不同TMUV毒株在小鼠模型中呈現顯著神經毒力差異
研究團隊通過顱內（i.c.）接種比較了三種鴨源TMUV毒株（CHN-YC、CQW1和SCS01）在昆明小鼠中的致病性。Cluster 2.2毒株CHN-YC表現出最強的神經侵襲性，感染后4天即引發顯著體重下降（P<0.001），6-7天內導致100%死亡率（8/8），腦組織病毒滴度高達10^3.875 TCID₅₀。相比之下，Cluster 2.1毒株CQW1僅引起37.5%死亡率（3/8），而SCS01毒株僅導致12.5%死亡（1/8）。值得注意的是，腹腔（i.p.）接種均未建立有效感染，提示TMUV的神經侵襲具有嚴格的接種途徑依賴性。

E-NS1區自然突變決定毒力表型
全基因組比對發現，Cluster 2.1毒株在E-NS1區存在19個特征性氨基酸變異。通過反向遺傳學將7個關鍵突變（E-N277S/V487A，NS1-K48E/T112M/A274V/I318T/I338T）引入CQW1骨架構建的CQW1-7M重組病毒，在小鼠中重現了Cluster 2.2的高毒力表型：90%死亡率（9/10），臨床評分達7.45分，腦內病毒載量較野生型提高10倍。單點突變驗證實驗顯示，E蛋白第487位纈氨酸→丙氨酸（V487A）是核心毒力決定因子，該突變使小鼠存活率驟降至10%（1/10）。

跨膜結構域突變增強病毒組裝機制
結構建模顯示，E-V487A位于E蛋白第二個跨膜結構域（TM2）中部，該區域富含疏水氨基酸。通過納米熒光素酶（NanoLuc）報告系統檢測發現，V487A使病毒包裝效率提升3倍（P<0.001）。進一步將487位點突變為甲硫氨酸（Met）可產生更強包裝效應，證實該位點疏水性改變直接影響病毒粒子形成。在DEF細胞和BHK-21細胞中的生長曲線顯示，V487A突變體復制動力學顯著增強，24小時病毒產量比野生型高1個對數級。

神經炎癥反應與病理損傷關聯
感染高毒力毒株的小鼠腦組織呈現典型病毒性腦炎病理特征：神經元變性壞死（綠色箭頭標記）、膠質細胞增生（藍色箭頭）和中性粒細胞浸潤（黑色箭頭）。qPCR檢測顯示，CHN-YC和CQW1-7M感染組促炎因子（IFN-γ、IL-6、TNF-α）表達量較對照組上調50-100倍，基質金屬蛋白酶（Mmp3）表達升高與血腦屏障破壞相關。值得注意的是，NS1-T112M突變體雖在體外復制正常，卻表現出顯著毒力衰減，提示NS1蛋白可能通過免疫調節途徑影響致病過程。

公共衛生意義與進化啟示
該研究首次闡明TMUV E蛋白跨膜區自然突變如何通過物理化學特性改變（疏水性降低）增強病毒適應性。鑒于TMUV在東南亞養鴨場工人中血清陽性率達15%-30%，且最新發現的Cluster 3毒株可通過鼻內感染致死ICR小鼠，E-V487A等關鍵位點的監測將為評估禽源黃病毒跨種傳播風險提供分子標記。研究采用的"進化逆向工程"策略（將現代毒株恢復為祖先基因型）為解析病毒表型進化提供了范式。

（注：全文嚴格依據原文實驗數據歸納，未添加非文獻記載內容；專業術語如TCID₅₀、i.c.等均按原文格式保留；去除了文獻引用標識[#B1]等及圖表索引[Fig 1]）