在神經科學領域，大腦中密集神經元群體的活動記錄一直是極具挑戰性的難題。神經元通過短暫的電信號 —— 動作電位（APs）進行計算和通信，這些僅持續約 1 毫秒的信號承載著感知、行為和思想的豐富信息。電壓敏感熒光蛋白可將 APs 轉化為熒光強度的快速變化，為測量神經元信號提供了手段，但在體內從密集神經元群體中提取這些信息面臨重重困難。

成像密集神經元的電壓信號需要高時空分辨率。雙光子顯微鏡雖能提供出色的空間分辨率，但其速度受限，尤其在成像大群體神經元時力不從心；單光子成像方法雖能實現千赫茲速度和大視野，但組織散射使得難以分辨緊密相鄰的神經元，限制了可同時研究的神經元數量和密度。散射不僅使神經元識別復雜化，還難以精確量化其反應，現有算法如 PCA、ICA、NMF 等需要神經元數量和 / 或位置的先驗知識，在密集標記樣本中常產生虛假或不純成分，無法捕捉單個細胞的活動。

為突破這一困境，國立陽明交通大學神經科學研究所與腦研究中心的研究人員開展了相關研究，成果發表在《Nature Methods》。

研究主要采用的關鍵技術方法包括：利用自定義寬場顯微鏡以 2000 幀 / 秒的速度對表達熒光電壓指示劑 Voltron2 的小鼠海馬 CA1 錐體神經元進行體內電壓成像；通過子宮內病毒注射將 Voltron2 表達限制在薄神經元層以減少離焦污染；運用基于奇異值分解（SVD）的去噪技術處理熒光變化圖像；采用峰值檢測算法對動作電位進行聚類分析；結合雙光子顯微鏡對同一視野進行結構成像以驗證 ALI 識別的神經元簇。

ALI 技術原理與驗證

研究人員引入活動定位成像（ALI）技術，其原理類似于超分辨率成像中的定位顯微鏡。盡管密集標記的神經元熒光重疊，但在任何給定時間只有稀疏的神經元群發放 APs。ALI 通過精確定位每個 AP 事件相關的熒光變化，創建 AP 發生的高分辨率圖。在小鼠海馬神經元的實驗中，通過檢測 APs 作為高通濾波熒光電影中的峰值，獲取每個 AP 峰值時間的熒光變化圖（ΔF 圖像），經 SVD 去噪后確定每個 AP 的中心位置，生成 AP 密度空間圖（ALI 圖像），可分辨四個不同的 AP 簇，且 AP 定位精度比光學信號的典型尺寸小得多（某些情況下超過十倍）。通過將 AP 聚類并平均 ΔF 圖像得到神經元 “足跡”，盡管存在散射引起的串擾，ALI 仍能通過識別重疊神經元及其足跡，利用最小二乘回歸提取發放和亞閾值活動，且串擾極低。

ALI 與現有算法在模擬數據中的對比

在模擬數據中，研究人員將 ALI 與 VolPy、SGPMD-NMF 等現有信號提取算法進行對比。模擬兩個具有固定足跡大小和恒定 AP 數量的神經元，分離度 s 設為 1.25w、1.0w、0.75w、0.5w 和 0.25w 以模擬重疊增加的情況。當分離度 s≥w 時，所有算法均能成功識別兩個模擬神經元；但當重疊超過散射極限（s<w）時，VolPy 和 SGPMD-NMF 無法檢測到兩個不同神經元，提取的軌跡混合了兩個神經元的真實脈沖序列，而 ALI 利用 AP 的精確位置，即使在最小分離度下也能準確分辨兩個神經元，忠實恢復兩者的足跡并提取與真實脈沖序列高度匹配的活動軌跡。

ALI 在大神經元群體中的成像

研究人員在體內以 2000 幀 / 秒的速度同時成像超過 100 個密集標記的海馬神經元，將圖像分成小補丁進行處理，組裝 AP 坐標生成 ALI 圖像，將 AP 分離成 113 個不同簇，確定各簇的足跡和對應活動軌跡。盡管熒光重疊，ALI 仍能揭示附近神經元不同的脈沖序列，相鄰感興趣區域（ROI）的信號相關性高，而 ALI 報告的活動相關性低，且 ALI 報告的脈沖序列有明確的不應期，ROI 脈沖序列常出現不應期窗口內的脈沖間隔（ISI）違規事件，表明 ALI 能有效避免強污染。

ALI 與結構識別神經元的對應關系

通過雙光子顯微鏡對電壓成像后的同一視野進行成像，發現 ALI 識別的所有簇（113 個）均可映射到雙光子 z 棧中識別的神經元，空間分布與雙光子圖像中的神經元位置精確匹配。部分雙光子 z 棧中可見的神經元未出現在 ALI 圖中，可能是記錄期間未發放 AP 的 “沉默細胞” 或 AP 太弱、位置太近無法與相鄰簇區分。

ALI 在體內與現有算法的對比

在相同體內數據集上，ALI 與 VolPy、SGPMD-NMF 對比，所有算法均能穩健識別分離良好的神經元，但在更擁擠的場景中，ALI 表現更優，能準確檢測緊密相鄰的神經元，而 VolPy 和 SGPMD-NMF 常將多個神經元合并為一個檢測細胞。在 ALI 識別的 106 對相鄰神經元（間距 < 35μm）中，僅 4.7% 和 18.9% 被 SGPMD-NMF 和 VolPy 區分為單獨細胞，且 SGPMD-NMF 約 44% 的檢測神經元存在活動污染。

ALI 在不同成像方式中的應用

ALI 還應用于先前發表的數據集，包括使用靶向照明的小鼠海馬小白蛋白（PV）中間神經元和使用光片顯微鏡的斑馬魚脊髓神經元。在靶向照明顯微鏡中，ALI 揭示一些照明光斑實際包含多個神經元；在光片顯微鏡中，ALI 能識別光片圖像中無法區分的神經元，提取其脈沖模式，顯示出在不同實驗條件下區分神經元活動的 versatility。

ALI 揭示密集 CA1 神經元的 θ 振蕩相位鎖定多樣性

在清醒行為小鼠的海馬 CA1 區，利用 ALI 以 2000 幀 / 秒同時記錄數百個錐體神經元，直接從群體發放模式中觀察到 θ 頻率節律。單個神經元表現出不同的相位調制，包括相位鎖定強度和偏好相位角的差異，且這種差異在緊密相鄰的神經元中常見。對間距 < 35μm 的 40 對相鄰神經元分析顯示，盡管鄰近，它們的相位鎖定強度和偏好相位角不同，隨機分配 AP 時相位調制差異顯著減小，表明 ALI 通過利用每個 AP 的空間信息，揭示了緊密相鄰神經元中 θ 相位鎖定的多樣性。

ALI 通過精確定位 AP，為解決散射組織中重疊神經元的分辨問題提供了簡單有效的方法，確立了精確定位作為提高分辨率的通用策略。該技術在體內能分辨現有信號提取算法和人類觀察者無法分辨的神經元，實現高密度、高速的神經元群體成像，直接觀察群體脈沖序列中的振蕩結構，區分密集局部網絡中神經元的特定相位鎖定。其優勢在于通過 AP 精確定位實現高分辨率，而非依賴大量像素，可利用有限相機像素實現更大視野，減少數據量和計算成本。

盡管 ALI 目前應用于單光子電壓成像，但其原理可能適用于雙光子功能成像、鈣成像、神經遞質成像等其他神經元功能成像，以及空間重疊信號的場景。未來，隨著指示劑亮度和靈敏度的提高、去噪算法的改進、光穩定性和記錄持續時間的改善、算法優化和成像硬件升級，ALI 有望更接近實現密集神經元回路中電壓動態的完整映射，為理解大腦功能和神經網絡機制提供強大工具。