大腦皮層是人類最復雜的器官之一，其結構以神經元和神經膠質細胞類型的顯著多樣性為特征，這些細胞構成了神經元回路。放射狀膠質祖細胞（RGPs）按照精確的時間順序程序，產生所有皮層興奮性投射神經元和神經膠質細胞類型。皮層興奮性投射神經元通過直接或通過中間祖細胞（IPs）的間接神經發生產生。然而，在皮層發育過程中如何產生廣泛的皮層細胞類型多樣性仍然是一個基本的開放性問題。RGPs 如何在數量和質量上產生所有新皮層神經元？直接和間接神經發生如何有助于建立神經元和譜系異質性？目前尚不清楚 RGPs 是代表均質和 / 或多能祖細胞群體，還是由異質群體組成。在本綜述中，我們將總結最新發現，這些發現有助于深入了解上述關鍵問題。

新皮層由大量不同的神經元和神經膠質細胞類型組成，這些細胞由放射狀膠質祖細胞（RGPs）依次生成，并組織成六個解剖學上不同的層。所有新生的皮層興奮性投射神經元以由內向外的方式徑向遷移穿過發育中的皮層板，因此早期出生的神經元位于較低層，而晚期出生的神經元位于成熟皮層板內的更上層。新皮層的六層結構是回路組裝和大腦功能的基礎，包括行為、學習、社交能力、語言、認知和運動技能。

在皮層發育過程中，神經上皮干細胞（NESCs）在腦室區（VZ）對稱分裂以擴增其數量。隨后，NESCs 分化為 RGPs。在小鼠發育早期，大約胚胎第（E）10-E12 天，RGPs 主要進行對稱增殖分裂以擴大其數量。在 E12 時，大多數 RGPs 將其分裂模式轉換為不對稱分裂，產生新生神經元（神經源性分裂）。RGPs 可以直接或通過中間祖細胞（IPs）間接生成神經元，IPs 遷移至腦室下區并進行基底分裂以生成兩個神經元。完成神經發生后，RGPs 獲得神經膠質發生潛力，并產生星形膠質細胞和少突膠質細胞譜系。皮層神經發生是一個精確、刻板且時間上精心安排的過程。

近年來，許多研究從定性和定量水平研究了單個 RGPs 的產出，以了解 RGP 譜系進展的原理。特別是具有單細胞分辨率的譜系追蹤技術，包括雙標記鑲嵌分析（MADM）技術，在小鼠新皮層中建立了 RGP 譜系進展的初步定量框架。單個 RGPs 產生約 8-9 個分布在皮層深層和淺層的神經元。神經發生完成后，約 1/6 的 RGPs 生成星形膠質細胞和 / 或少突膠質細胞祖細胞，進而生成成熟的星形膠質細胞和少突膠質細胞。

皮層發育的破壞，包括神經元的異常生成、神經元遷移和回路組裝的缺陷，是許多神經系統和神經發育障礙的主要潛在病因，如癲癇、自閉癥譜系障礙和一般皮層畸形。因此，皮層發育的每一步都必須得到良好的調節和執行，以最終確保正常的大腦功能。然而，我們對指導皮層個體發生的關鍵分子和細胞機制仍缺乏完整的了解。在本綜述中，我們將重點關注最近揭示指導發育中新皮層興奮性投射神經元細胞類型多樣性產生的細胞和分子機制的研究。

大腦皮層由數十種興奮性投射神經元細胞類型組成。雖然細胞類型的定義需要多個標準，但皮層投射神經元可以根據層位、轉錄組 / 表觀遺傳特征、電生理特性和軸突投射進行分類。許多 recent studies 聚焦于研究神經元多樣性與其特性之間的關系，例如采用 Patch-seq 技術揭示空間、電生理、形態和轉錄組特征；而 MAPseq 和 BARseq 方法則用于破譯軸突投射與突觸后靶點之間的關系。慢病毒方法，包括 TREX、STICR 和 TrackerSeq，能夠基于轉錄組特征追蹤克隆關系。未來，MADM-CloneSeq 和 / 或基于 FISH 的方法與稀疏克隆標記相結合，有望分析定義的克隆相關皮層投射神經元單元內的細胞類型多樣性，并保留空間和形態學信息。盡管上述強大的技術允許在群體和克隆水平上更好地理解神經元特性與細胞類型多樣性之間的關系，但 RGPs 如何在單個祖細胞水平上精確產生細胞類型多樣性仍不清楚。

大量實驗數據表明，間接神經發生可能在大腦皮層神經元多樣性的建立中起關鍵作用。有趣的是，Huilgol 等人最近在小鼠中使用一種巧妙的遺傳命運映射方法表明，在胚胎發育后期，大多數興奮性投射神經元由 IPs 產生，尤其是在海馬和新皮層中。IPs 似乎不僅在每個特定類別 [端腦內、錐體束和皮質丘腦] 內擴增投射神經元，而且至少在群體水平上基于軸突投射模式使 RGP 衍生的克隆單元多樣化。此外，盡管確切的神經元層輸出是可變的，但最近的一項研究表明，間接神經發生影響層分布，產生以 L6 為主的神經元輸出的克隆。Buchan 等人表明，與其他祖細胞相比，源自 L4 中 IPs 的神經元表現出特定的樹突形態，并接受更多的高階丘腦輸入，突出了 IPs 在建立突觸連接中的作用�？傊�，上述發現表明，與同一 RGP 的直接神經發生相比，間接神經發生不僅在整體上擴增神經元輸出，而且以偏向的方式產生功能不同的投射神經元類型。然而，IPs 如何產生功能不同的皮層投射神經元類別的程度仍不完全清楚，需要進一步的實驗，理想情況下在單細胞水平上進行。更一般地說，上述數據還表明，就時空水平上 IP 產生的速率而言，RGPs 可能構成比以前預期的更多樣化的群體。未來在單個 RGP 和克隆水平上的努力可能會提供明確的答案。

在小鼠視覺皮層中，由同一 RGPs 產生的克隆相關神經元傾向于彼此形成突觸，并具有相似的生理特性，如偏好方向和方向選擇性。有趣的是，克隆相關的 “姐妹” 神經元（源自不對稱分裂的 RGP 的克隆單元內）形成垂直和水平突觸連接，而克隆相關的 “表親” 神經元（源自一個分裂周期前對稱 RGP 分裂的兩個克隆單元之間）主要形成水平突觸連接。這些數據表明，克隆關系的水平（“姐妹” 與 “表親”）對皮層微電路中神經元連接的水平和特異性有重要貢獻。在分子水平上，由同一 RGPs 產生的興奮性神經元表現出特定的原鈣粘蛋白（cPCDH）細胞表面分子組合的相似表達模式，這與非克隆相關神經元不同。此外，與其他層的神經元相比，位于同一皮層層的神經元表現出 cPCDH 表達的高度相似性。上述結果揭示了克隆身份、細胞粘附分子表達和生理特性之間的有趣聯系。實驗數據還表明，克隆相關投射神經元存在一定程度的轉錄收斂（即 cPCDH 的特異性表達）。然而，其他數據提供的證據表明，具有相似整體轉錄組譜的皮層興奮性神經元大多屬于不同的譜系，這與克隆相關的 GABA 能神經元表現出截然不同的轉錄組譜不同。此外，在 RGP 譜系進展的特定步驟中起作用的轉錄后機制也不能排除。因此，未來的研究不僅要確定克隆相關投射神經元之間轉錄收斂和發散的精確水平，還要確定表觀遺傳和轉錄后特征，以及基因表達通常如何定義甚至指導克隆關系，這將是重要的。

單個 RGPs 如何在譜系進展過程中產生不同類別的皮層興奮性投射神經元是一個重要的未解決問題。已建立了兩種主要的生物學理論作為最可能的假設：“漸進能力限制模型” 和 “命運限制祖細胞模型”。第一種理論指出，神經元以可預測的方式產生，其中每個 RGP 是多能的，并且有潛力在發育過程中產生所有投射神經元細胞類型。經典和更現代的移植實驗支持該模型。還表明，單個 RGPs 具有主要的神經元層輸出潛力，50% 的新生神經元最終位于確定的皮層層。然而，相當一部分 RGP 衍生的克隆單元在某些層中缺乏投射神經元（例如，15% 的克隆在第 5 層中缺少神經元），這表明克隆輸出在一定程度上是異質的。為了定義克隆異質性的水平，未來需要超越層位，用明確的標準系統評估 RGP 衍生克隆的結構。盡管已經觀察到克隆結構的一些差異，但第一個模型假設所有 RGPs 本質上都是多能的。然而，不能排除塑造最終克隆結構的有絲分裂后機制。相反，第二種模型提出，RGP 群體包括不同的類別，其中某些 RGPs 僅產生神經元的受限子集。雖然第二種模型沒有得到實驗數據的廣泛支持，并且仍然存在一定的爭議，但最近的命運映射數據為第二種模型提供了一些更多的支持，盡管大多數實驗是在群體水平上進行的。

最近采用單細胞測序方法的努力不僅基于轉錄組特征（t 型）徹底改變了細胞類型的表征，而且通過偽時間和軌跡分析實現了計算機內譜系追蹤�；�于單細胞測序分析，在小鼠中，RGP 群體顯得相對均質，沒有強有力的證據表明存在轉錄上不同類別的 RGPs。然而，來自雪貂的最新數據表明，存在許多轉錄上不同類別的 RGPs，這似乎與其在 VZ 中的空間位置相關，具體取決于未來的腦回或腦溝是否會出現。然而，雪貂中不同 RGPs 在個體祖細胞水平上是否具有不同的數量和質量特征，其生物學相關性仍有待確定。

值得注意的是，盡管存在細胞變異性，但在統計譜系推斷模型中，小鼠的興奮性投射神經元共享相對相似的時間細胞分化軌跡。此外，根據 scRNA-seq 數據的無偏聚類，皮層投射神經元似乎來自一個共同的祖細胞分支。這些最新結果可能支持小鼠中存在均質祖細胞群體的觀點。相比之下，單細胞轉錄組分析與 TrackerSeq 的結合揭示了雪貂（P1）和人類（GW17-18）中來自不同 RGPs 的祖細胞的三種軌跡，而對先前小鼠數據（E15.5）的重新分析顯示單一軌跡。這些數據提出了一種進化策略的可能性，即根據（物種特異性的）成熟皮層大小調整最終的 RGP 輸出。然而，需要提到的是，另一項采用小鼠樣本更深測序的研究可以定義三種潛在軌跡。盡管不同的轉錄軌跡可能表明譜系變異，但需要注意的是，投射神經元多樣性與特定軌跡沒有相關性。

除了人類和雪貂中的多種轉錄軌跡（這可能在一定程度上構成物種特異性特征）外，有趣的新數據表明，人類 RGPs 表現出甚至更高水平的多能性。實際上，Delgado 等人表明，在人類皮層發育過程中，某些 RGPs 不僅可以產生皮層投射神經元，還可以產生抑制性神經元譜系，最新數據證實了這一概念。根據小鼠的當前數據，這種水平的 RGP 多能性似乎是皮層祖細胞的人類特異性特征。然而，發育中小鼠腦更尾部區域的干細胞龕和 / 或單個 RGPs 也已被證明在產生興奮性和抑制性神經元方面具有雙能性。因此，破譯小鼠新皮層 RGPs 與來自不同干細胞龕的 RGPs 之間的共性和差異，以及與人類皮層雙能 RGPs 的比較，將是有趣的。

RGP 譜系進展以及皮層投射神經元多樣性的產生被認為受強大的 RGP 內在驅動調節。事實上，經典和最新的體外研究支持這種機制，因為 RGPs 能夠即使在組織環境外也能產生大量不同的投射神經元。有趣的是，已描述了 RGPs 在發育過程中的動態基因表達模式，具有隨時間變化的特定轉錄因子基序和網絡，并與神經發生期間的神經元類型特異性相關。此外，RGPs 中表觀遺傳調控的時間胎記和神經元特異性標記顯示出連續的表達波，這可能有助于 RGP 譜系進展期間神經元輸出的多樣性。連續的基因表達程序被認為調節特定的細胞生物學和 / 或代謝狀態，進一步指導細胞分裂模式和新生神經元的潛在命運。例如，細胞周期長度的變化已被證明調節 RGP 衍生的 IP 輸出和一般神經源性潛力。線粒體相關代謝也影響 RGP 增殖行為，甚至可能以物種特異性方式影響。

最近的研究強調了細胞外信號和其他非細胞自主機制在產生細胞類型多樣性中的關鍵作用。細胞外基質的成分，如 IV 型膠原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和層粘連蛋白，調節神經干細胞分化。此外，其他細胞外信號，如細胞外囊泡，有助于神經祖細胞增殖和 specification，表明這些（和可能其他）非細胞自主機制對于塑造細胞類型多樣性也是必不可少的。

有趣的是，盡管體外模型系統概括了 RGP 譜系進展的許多方面，但也觀察到了特定皮層投射神經元的相對 RGP 輸出分數的某些改變，這意味著關鍵的龕衍生和 / 或全組織范圍因子的本質。關鍵外在信號的確切性質仍不清楚，但它們可能來自多種來源，包括機械支持細胞、未成熟新生投射神經元、中間神經元、血液或腦脊液。未來的努力應該建立精確的定量體外系統，以能夠系統地探測可能影響整體 RGP 輸出的各種信號。結合體內數據，這些努力應該提供對 RGP 內在程序和外在信號在調節 RGP 譜系進展中的相互作用的更深入理解，并最終產生皮層細胞類型多樣性。

近年來，在表征哺乳動物大腦中各種神經元細胞類型方面取得了重大進展，特別是在新皮層方面。先進工具和技術的發展對于揭示皮層發育過程中協調細胞類型多樣性的分子和細胞機制至關重要。然而，新皮層中的 RGPs 是否真正具有多能性，或者它們是否以不同的形式存在，仍然是一個懸而未決的問題。需要進一步的研究來闡明發育中大腦皮層中 RGPs 的定性和定量潛力，特別是通過研究單個 RGPs 對神經元細胞類型產生的輸出貢獻。未來的工作還應該建立精確的定量框架，以便系統地探索影響和調節 RGP 譜系進展的各種信號，如表觀遺傳調控機制、轉錄組特征和狀態、轉錄后修飾，尤其是物種特異性差異。最終，深入研究 RGP 譜系進展、多能性和皮層細胞類型多樣性的全譜出現的細胞和分子機制是必要的。這些見解不僅將增強我們對一般皮層發育的理解，還將闡明神經發育和神經系統疾病的潛在病因。