《Nature Communications》：Auricular malformations are driven by copy number variations in a hierarchical enhancer cluster and a dominant enhancer recapitulates human pathogenesis
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【編輯推薦】為探明雙耳收縮畸形（BCE）機制，研究人員對 7 個中國 BCE 家系展開研究，發現染色體 4 上 HMX1 下游增強子簇（PI-HEC）拷貝數變異（CNV）致病。PI-HEC 通過協同調控 HMX1 表達影響耳發育，揭示哺乳動物耳形態發生的復雜調控網絡。
耳朵，作為人類感知世界的重要器官，其發育過程蘊含著復雜的生物學奧秘。在發育生物學領域，哺乳動物胚胎發育過程中復雜的形態變化一直是研究的核心焦點，而耳朵的發育更是其中的典型代表。人類耳朵結構精細，起源于顱神經嵴細胞（CNCCs）和三個胚層，其發育過程涉及多種發育過程和進化適應的獨特相互作用。外耳作為耳朵的重要組成部分，不僅承擔著捕捉聲波的關鍵功能，其形態多樣性在進化及多種疾病中也有顯著體現。然而，相較于中耳和內耳，外耳發育異常的分子機制卻一直籠罩在神秘的面紗之下，尤其是雙耳收縮畸形（Bilateral Constricted Ear, BCE），這種常表現為常染色體顯性遺傳的疾病，主要特征為外耳上部卷曲，涉及耳輪、舟狀窩和對耳輪等結構的異常，其背后的致病機制長期未被明確闡明。
在這樣的背景下，廣州國家實驗室、北京航空航天大學等國內研究機構的研究人員，針對這一科學難題展開了深入研究。他們的研究成果發表在國際知名期刊《Nature Communications》上，為揭示 BCE 的發病機制帶來了重大突破。
研究人員首先對 7 個中國 BCE 家系進行了全面的遺傳學分析。通過基因芯片和下一代測序技術，他們在染色體 4 上定位到一個名為 BCE 核心 locus 的關鍵區域，該區域包含三個協同作用的增強子，研究人員將其命名為位置身份層級增強子簇（Positional Identity Hierarchical Enhancer Cluster, PI-HEC）。為了深入探究這些增強子的功能，研究人員采用了多種關鍵技術方法。在樣本層面，他們收集了家系成員的血液樣本進行 DNA 提取和基因分型，并利用靶向捕獲測序和全基因組測序對致病區域進行精細定位。在細胞模型方面，通過培養人類胚胎干細胞（hESCs）并誘導其分化為顱神經嵴細胞（hCNCCs），構建了研究增強子功能的體外平臺。在動物模型構建上，運用 CRISPR/Cas9 技術創建了多種基因編輯小鼠模型，包括 mEC1 缺失和重復模型，以模擬人類 BCE 的遺傳變異。此外，還借助啟動子捕獲 Hi-C（PCHi-C）、染色質免疫沉淀測序（ChIP-seq）、單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）等技術，從基因組相互作用、表觀遺傳調控和單細胞基因表達等多個維度解析增強子的作用機制。
拷貝數重復與 BCE 的關聯
通過對家系的遺傳分析，研究人員發現所有 BCE 患者均存在染色體 4 上 BCE 核心 locus 的拷貝數重復（拷貝數 = 3）。該區域位于 HMX1 基因下游的非編碼區，通過 Hi-C 數據發現其與 HMX1 啟動子存在相互作用，提示 HMX1 和 CPZ 可能是潛在的靶基因。這一發現首次明確了該非編碼區域的拷貝數變異與 BCE 的直接關聯。
增強子簇與 HMX1 啟動子的相互作用
進一步研究發現，BCE 核心 locus 包含三個潛在的增強子 EC1、EC2 和 EC3。通過整合人類胚胎顱面組織和體外 hCNCCs 的表觀基因組數據，證實這些增強子在特定細胞和發育階段具有活性。PCHi-C 分析顯示，增強子簇在 hCNCCs 中與 HMX1 啟動子特異性相互作用，而在人類胚胎干細胞（hESCs）中則無此作用，表明其活性具有時空特異性和細胞類型特異性，且主要調控 HMX1 的表達，而非鄰近基因 CPZ。
增強子的動態活性與協同調控
對 hCNCCs 分化過程中增強子活性的分析表明，不同增強子具有獨特的活性模式。hEC1 在晚期 hCNCCs 和 PA 樣 hCNCCs 中表現出強轉錄激活作用，是主要的增強子；hEC2 活性較弱，在早期 hCNCCs 階段開始激活；hEC3 雖與 HMX1 啟動子相互作用，但缺乏典型的活性組蛋白標記，可能作為結構元件促進增強子簇與啟動子的接觸。通過小鼠轉基因實驗發現，三個增強子通過協同作用精細調控 HMX1 在咽弓 2（PA2）區域的時空表達，其中 hEC1 主導轉錄輸出，hEC2 和 hEC3 提供補充的位置信息，共同構成 PI-HEC，確保 HMX1 在 PA2 區域的精確表達模式。
增強子的分子調控機制
對 hEC1 的深入研究揭示了其調控機制的復雜性。通過基序分析和功能實驗，發現 hEC1 的活性和特異性受多種轉錄因子（TFs）的協同調控，包括 TALE 型同源域轉錄因子（如 MEIS1、PBX1）、高遷移率族（HMG）盒轉錄因子（如 TCF7L2）和協調子（Coordinator）基序結合的轉錄因子（如 TWIST1）。這些轉錄因子通過結合 hEC1 上的特定基序簇，形成復雜的調控網絡，確保增強子在特定細胞和發育階段的功能。
小鼠模型中的表型與機制驗證
在小鼠模型中，mEC1 重復導致 Hmx1 在耳郭基底區和成纖維細胞中異常表達，并擴展至遠端區域，引發耳郭發育異常，包括耳輪面積減小、角度改變等，與人類 BCE 表型相似。單細胞測序和批量 RNA 測序顯示，Hmx1 異常表達通過抑制成纖維細胞、軟骨細胞、肌細胞和表皮細胞的分化相關基因，干擾耳郭的正常發育，揭示了 Hmx1 在顱神經嵴來源的成纖維細胞中的關鍵作用。
這項研究首次系統闡明了 BCE 的致病機制，證明 PI-HEC 的拷貝數變異通過協同調控 HMX1 的時空表達導致外耳發育異常。研究結果不僅揭示了哺乳動物耳形態發生的復雜調控網絡，也為理解增強子與轉錄因子的協同作用提供了新范式。此外，研究中構建的小鼠模型和發現的關鍵調控元件，為 BCE 的基因診斷和未來靶向治療奠定了堅實基礎，有望推動顱面畸形領域的精準醫學發展。研究還強調了非編碼區遺傳變異在發育性疾病中的重要性，為解析復雜遺傳病的機制提供了新的思路和方法。
