《Nature Communications》：Inhibiting peptidylarginine deiminases (PAD1-4) by targeting a Ca2+ dependent allosteric binding site
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蛋白瓜氨酸化與類風濕關節炎、神經退行性疾病及癌癥等相關，其由 PAD 家族酶催化。研究人員針對 PAD1-4 的變構結合口袋開展研究，通過虛擬篩選等發現新型抑制劑，可穩定無催化活性構象，抑制多酶并在中性粒細胞中效果更廣泛，為相關疾病治療提供新方向。
在生命科學與醫學領域，蛋白翻譯后修飾的調控機制一直是研究熱點。蛋白瓜氨酸化（Protein Citrullination）作為一種特殊的翻譯后修飾，是指精氨酸殘基在肽基精氨酸脫亞氨酶（Peptidylarginine Deiminases，PADs）的催化下轉化為瓜氨酸的過程。這一過程依賴鈣離子（Ca2?），且與多種重大疾病密切相關。目前已知，PAD 家族包括 PAD1-4 和 PAD6，其中 PAD1-4 具有催化活性，而 PAD6 被認為無酶活性。異常的蛋白瓜氨酸化水平與類風濕關節炎（Rheumatoid Arthritis，RA）、神經退行性疾�。ㄈ绨柎暮Ｄ�、肌萎縮側索硬化癥）以及癌癥的發生發展緊密相連。例如，在類風濕關節炎中，中性粒細胞發生 NETosis（一種程序性細胞死亡，釋放中性粒細胞胞外陷阱 NETs）時，瓜氨酸化蛋白和 PAD 酶會釋放到關節滑膜等組織，引發炎癥反應，且抗瓜氨酸化蛋白抗體（ACPAs）是 RA 進展的診斷指標之一。然而，針對 PAD 家族的抑制劑研發仍存在挑戰，現有抑制劑多為共價底物類似物，選擇性有限，且缺乏對 PAD1-4 的廣譜抑制手段。
為了突破這一困境，來自輝瑞公司（Pfizer Inc.）的研究人員開展了相關研究，旨在尋找一種能高效抑制 PAD1-4 的非共價變構抑制劑，為相關疾病的治療提供新策略。該研究成果發表在《Nature Communications》上，為 PAD 家族抑制劑的開發和疾病治療帶來了新的希望。
研究人員采用了多種關鍵技術方法：首先利用基于配體的虛擬篩選（Ligand-based Virtual Screen），從輝瑞化合物庫中篩選潛在抑制劑；通過表面等離子體共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）技術驗證靶點結合特性；運用共晶體結構分析（Co-crystal Structure Analysis）揭示配體與酶的結合模式；借助熒光淬滅（Fluorescence Quenching，FQ） assay、谷氨酸脫氫酶（Glutamate Dehydrogenase，GDH）酶偶聯 assay 等評估抑制劑的酶活性抑制效果；利用熱位移分析（Thermal Shift Assay）和中性粒細胞實驗驗證抑制劑的細胞水平作用。此外，研究中使用的人源中性粒細胞樣本來自健康成人 donors，符合倫理規范。
PAD4 抑制劑的虛擬篩選與結合特性
研究人員以 PAD4 選擇性配體 GSK147 為種子分子，通過二維指紋數據融合方法對輝瑞化合物庫（430 萬化合物）進行虛擬篩選，篩選出的前 1250 個化合物經熒光檢測氨釋放實驗初篩，發現 PAD-PF1 對 PAD4 介導的 BAEE 脫亞胺反應有抑制作用（56% 抑制率）。進一步的 FQ 實驗顯示，PAD-PF1 在 0.4 mM Ca2?條件下對 PAD4 的 IC??為 15.9 μM。SPR 實驗表明，PAD-PF1 與 PAD4 的結合親和力 KD 為 2.82 μM，但與 GSK147 無競爭結合，提示其結合位點不同。
變構結合位點的結構解析
通過解析 PAD4、PAD-PF1 和 GSK147 的三元復合物晶體結構（分辨率 2.41 ?），發現 PAD-PF1 結合于 PAD4 的 IG2 結構域（免疫球蛋白結構域 2）與催化結構域（Catalytic Domain，CD）界面的變構口袋，而非 GSK147 所在的活性位點附近。其溴苯基插入 Phe368、Phe407 和 Leu447 等疏水殘基之間，吡咯并嘧啶環與 Phe450 堆疊，并通過氫鍵與 IG2 結構域的 Leu254、Phe256 等相互作用。該結合導致酶構象穩定在無催化活性的鈣離子缺失狀態，且與 GSK147 可同時結合，兩者聯用對 PAD4 酶功能具有協同抑制作用。
廣譜抑制劑 PAD-PF2 的優化與特性
基于 PAD-PF1 的結合模式，研究人員通過結構引導的迭代設計，將吡咯并嘧啶環替換為異喹啉環，引入 3,5 - 二氯吡啶基團，開發出高效抑制劑 PAD-PF2。其對 PAD4 的 IC??低至 42.7 nM，且對映體 ent-PAD-PF2 活性顯著降低（IC??=26.0 μM），表明立體結構對活性至關重要。由于 PAD1-4 在變構口袋周圍氨基酸序列高度同源，PAD-PF2 對 PAD1-3 亦有強效抑制作用，在 0.25 mM Ca2?條件下，對 PAD1、PAD2、PAD3、PAD4 的 IC??分別為 109 nM、28.5 nM、106 nM、24.0 nM。鈣濃度依賴性實驗顯示，當 Ca2?濃度升高至 1.5 mM 時，PAD-PF2 對 PAD2 和 PAD4 的 IC??分別升高 111 倍和 35 倍，表明其抑制機制與干擾鈣離子結合相關。
中性粒細胞中的抑制效果
在人源分離中性粒細胞實驗中，離子霉素刺激可誘導蛋白瓜氨酸化，PAD-PF2 對瓜氨酸化組蛋白 H3（citH3）的抑制 IC??為 1.0 μM，與 GSK147（1.1 μM）相當，但對廣譜瓜氨酸化蛋白（F95 抗體檢測）的抑制更為完全（IC??=1.5 μM），而 GSK147 僅能部分抑制（39%）。Western blot 分析顯示，PAD-PF2 可抑制更多蛋白的瓜氨酸化，證實其因抑制多種 PAD 同工酶而具有更廣泛的底物覆蓋范圍。
結合模式與抑制機制
PAD-PF2 與 PAD2 和 PAD4 的共晶體結構（分辨率分別為 1.77 ? 和 2.44 ?）顯示，其異喹啉環與對應疏水殘基（如 PAD4 的 Phe368、Phe450，PAD2 的 Leu369、Phe450）形成廣泛疏水相互作用，二氯吡啶基團與 Pro372 接近，可能干擾 Ca2?結合位點（如 Ca2 位點）的形成。在 PAD2 結構中，結合 PAD-PF2 后，Arg347 “封閉” 底物結合口袋，Cys647 偏離活性位點，且 Ca2 結合所需的 Asp370、Glu352 等殘基構象改變，導致鈣離子無法結合，酶處于無活性狀態。這一機制與 GSK147 雖結合不同位點但均誘導無活性構象的現象一致。
研究結論與意義
本研究首次揭示了 PAD1-4 共有的變構結合口袋，開發出非共價、廣譜的 PAD1-4 抑制劑 PAD-PF2。其通過穩定鈣離子缺失的無活性構象，實現對多種 PAD 同工酶的高效抑制，且在中性粒細胞中表現出比 PAD4 選擇性抑制劑更廣泛的瓜氨酸化抑制效果。這一成果不僅為深入研究蛋白瓜氨酸化的生理病理作用提供了有力工具，也為類風濕關節炎、神經退行性疾病和癌癥等與 PAD 相關疾病的治療開辟了新方向。未來，基于該變構位點的抑制劑優化有望進一步提高選擇性和療效，為臨床轉化奠定基礎。
