《Nature Communications》：Alternative splicing across the C. elegans nervous system
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為解析可變剪接（AS）在神經元身份和功能調控中的作用，研究人員以秀麗隱桿線蟲為模型，構建神經系統 AS 圖譜。發現近 2000 個基因存在差異 AS，鑒定 unc40/DCC 等新 AS 事件，構建調控網絡，為神經發育和疾病研究提供新視角。
在生命科學領域，神經元的多樣性和功能調控一直是備受關注的核心問題�？勺兗艚樱ˋlternative Splicing, AS）作為轉錄組多樣化的關鍵機制，在神經元身份決定和功能調節中扮演重要角色。然而，神經系統中 AS 的全局模式、調控機制及其與神經元類型的關系尚未完全明晰。尤其在單細胞分辨率下，不同神經元類型的 AS 差異及其功能影響仍需深入探索。為填補這些研究空白，來自耶魯大學醫學院、范德堡大學等機構的研究人員聚焦秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）神經系統，開展了系統性的 AS 研究，相關成果發表在《Nature Communications》。
研究人員利用熒光激活細胞分選技術（Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS）從 L4 雌雄同體線蟲中分離出 55 種單個神經元類型，結合優化的核糖體耗竭 RNA 測序（RNA-Seq）技術，生成了高分辨率的 AS 數據集。通過整合原始數據可視化、局部定量和轉錄本水平定量三種分析方法，全面解析 AS 模式。
可視化與定量分析揭示 AS 多樣性
通過基因組瀏覽器 JBrowse2 可視化分析，研究人員在 ric-4 基因中發現其可變第一外顯子在 NSM 和 PVM 神經元中呈現差異使用，其中 NSM 優先表達遠端外顯子（ric-4a），而 PVM 更傾向使用近端外顯子（ric-4b），這一結果通過 MAJIQ 軟件的局部剪接變異（Local Splicing Variation, LSV）分析得到進一步驗證。轉錄本水平定量工具 StringTie 的數據顯示，ric-4a 和 ric-4b 在不同神經元中的表達比例與功能差異密切相關，表明 AS 在神經元特異性功能調控中的重要性。
新 AS 事件的發現與驗證
研究發現，軸突導向受體基因 unc-40/DCC 存在兩個新外顯子（exon 8.5 和 exon 14.5），其中 exon 14.5 在 AVM 神經元中特異性插入，而在其他神經元如 AVL、AWA 中則被跳過。RT-PCR 驗證了這些新轉錄本在整體動物中的存在，且在近緣物種中發現保守的同源外顯子，提示其功能重要性。類似地，Slit 受體基因 sax-3/ROBO 鑒定出新型可變第一外顯子 5.5 和 exon 9 的可變剪接位點，前者產生缺乏部分免疫球蛋白結構域的短異構體 SAX-3S，后者影響胞內結構域氨基酸序列，兩者在不同神經元類型中差異表達，且在進化上高度保守。
全局 AS 模式與功能富集
通過 MAJIQ 分析，研究人員在 1940 個基因中檢測到差異可變剪接（Differential Alternative Splicing, DAS），基因本體論（Gene Ontology）分析顯示這些基因顯著富集于神經元功能相關通路，如離子通道和神經遞質傳遞。進一步分析發現，鉀通道和電壓門控鈣通道基因中 DAS 發生率較高，而核糖體亞基和神經肽編碼基因的 AS 模式相對保守，提示 DAS 在神經元興奮性精細調控中的關鍵作用。通過對 55 種神經元的成對比較，發現具有相似功能的神經元如纖毛感覺神經元群（ASK、ADF 等）呈現相似的 AS 譜，表明 AS 模式與神經元功能特化的關聯性。
序列特征與微外顯子的作用
對 AS 事件的序列特征分析表明，差異可變剪接的可變第一外顯子通常具有較長的外顯子長度和較低的遠端內含子保守性，可能與轉錄起始位點的調控相關。而 cassette exons 中，微外顯子（≤27 bp）的 DAS 發生率顯著高于較長外顯子（75% vs 59%），且在神經元對中的差異剪接比例更高，進一步支持微外顯子在神經系統中的重要性。此外，框架移位（Potentially Frame-Shifting, PFS）事件在可變剪接位點中略有減少，但在基因兩端富集，提示其對蛋白質 N - 或 C - 末端的調控作用。
剪接調控網絡的構建
基于 cassette exons 的外顯子剪接包含率（ePSI）和 239 個推定剪接因子（Splice Factor, SF）的表達數據，研究人員構建了剪接調控網絡。通過五折交叉驗證和多種算法比較，最終選擇 glasso 算法構建的網絡，其稀疏性達 97%，可解釋 80% 的 ePSI 變異。網絡中，已知剪接因子如 mbl-1、unc-75 等位于核心節點，同時鑒定出 etr-1、sma-9 等新型調控因子。針對特定基因如 C07A12.7 和 daf-2 的子網絡分析，成功捕獲已知調控關系并預測新的互作因子，為 AS 調控機制的深入研究提供了豐富假說。
研究結論與意義
該研究首次在單細胞類型分辨率下構建了秀麗隱桿線蟲神經系統的 AS 圖譜，鑒定出大量新 AS 事件，揭示了 DAS 在神經元功能特化中的廣泛作用。通過整合多維度數據，構建了首個線蟲神經 AS 調控網絡，為解析 AS 的轉錄后調控機制提供了關鍵資源。研究結果不僅深化了對神經元多樣性分子基礎的理解，也為神經系統疾�。ㄈ缱蚤]癥、神經退行性疾�。┲� AS 異常的研究提供了重要模型和理論依據。未來，結合單細胞長讀長測序技術，有望進一步揭示 AS 在神經元異質性和動態發育中的復雜調控網絡。
