《Cell Death Discovery》：USP18 deubiquitinates and stabilizes SOX9 to promote the stemness and malignant progression of glioblastoma
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膠質母細胞瘤（GBM）預后差，其干細胞（GSCs）是關鍵。研究聚焦去泛素化酶 USP18，發現其在 GBM 中高表達，通過結合 SOX9 并去除 K48 泛素鏈穩定后者，且受 YY1 轉錄調控。揭示 YY1/USP18/SOX9 軸，為 GBM 治療提供新靶點。
膠質母細胞瘤（glioblastoma, GBM）作為中樞神經系統最常見且惡性程度最高的原發性腫瘤，盡管當前采用手術聯合放化療的標準治療方案，但患者中位生存期僅約 14 個月，預后極差。這主要歸咎于 GBM 中存在具有自我更新和多向分化能力的膠質母細胞瘤干細胞（glioblastoma stem cells, GSCs），其不僅推動腫瘤的增殖、侵襲、耐藥和復發，還導致腫瘤異質性顯著，使得徹底清除腫瘤細胞成為臨床難題。因此，深入探究調控 GSCs 干性維持和腫瘤惡性進展的分子機制，尋找有效的診斷生物標志物和治療靶點，成為 GBM 研究領域的迫切需求。
在這樣的背景下，南京醫科大學第一附屬醫院等機構的研究人員開展了相關研究，旨在揭示去泛素化酶（deubiquitinase, DUB）家族成員在 GBM 中的作用機制。該研究成果發表在《Cell Death Discovery》上，通過多維度實驗揭示了 USP18 在 GBM 中的關鍵作用及調控網絡，為 GBM 的治療提供了新的思路和潛在靶點。
研究人員主要運用了以下關鍵技術方法：首先，利用生物信息學分析（如 Synapse 數據庫單細胞數據分析、TCGA 和 CGGA 等公共數據庫挖掘）篩選出與 GSCs 相關的關鍵基因 USP18；其次，通過臨床樣本（90 例膠質瘤組織）的免疫組織化學（IHC）、蛋白質免疫印跡（Western blot）等實驗驗證 USP18 的表達與患者預后的相關性；再者，構建 USP18 敲低和過表達的細胞模型（U87、LN229 等膠質瘤細胞系及 GSC23、T3264 等 GSC 模型），結合神經球形成實驗、Transwell 遷移侵襲實驗、EdU 增殖實驗等評估其對細胞干性和惡性表型的影響；此外，通過免疫共沉淀（Co-IP）、質譜分析、泛素化實驗等探究 USP18 與 SOX9 的相互作用及調控機制；最后，利用小鼠原位異種移植模型驗證 USP18/SOX9 軸在體內對腫瘤生長的影響。
USP18 在膠質瘤細胞及 GSCs 中高表達并與不良預后相關
通過分析 Synapse 數據庫的膠質瘤單細胞數據，發現 USP18 在高表達 GSC 標記基因的簇 2 和簇 3 中富集。結合 TCGA-GBM 數據集的加權基因共表達網絡分析（WGCNA），確定 USP18 所在的 MEblack 模塊與 GSCs 比例高度相關。多個公共數據集（如 GSE124145、GSE4290）顯示，USP18 在膠質瘤組織及 GSCs 中的表達顯著高于正常腦組織及非干細胞，且其表達水平與膠質瘤 WHO 分級呈正相關，在 IDH 野生型及無 1p/19q 共缺失的膠質瘤中表達更高。臨床樣本的 Western blot 和 IHC 結果進一步驗證了 USP18 的高表達，且 Kaplan-Meier 生存分析表明 USP18 高表達患者生存期更短，提示其作為預后標志物的潛力。
USP18 沉默抑制膠質瘤細胞惡性表型及干性
在 U87 和 LN229 細胞中敲低 USP18 后，細胞活力、克隆形成能力、EdU 陽性率顯著降低，遷移和侵襲能力減弱。在 GSC 模型中，USP18 敲低導致神經球形成能力下降，腫瘤球形成頻率降低，同時干細胞標志物 CD133、Nestin、SOX2、NANOG 的蛋白水平下調，表明 USP18 對維持 GSCs 干性至關重要。
USP18 過表達通過 DUB 酶活性促進膠質瘤細胞惡性表型及干性
在 USP18 低表達的 U251 和 A172 細胞中過表達野生型 USP18（WT-USP18），顯著增強細胞增殖、遷移和侵襲能力，而催化失活突變體 USP18-C64S 則無此作用。在 GSCs 中，WT-USP18 過表達增加神經球形成能力，且干細胞標志物表達上調，進一步證實 USP18 的功能依賴于其去泛素化酶活性。
USP18 直接結合 SOX9 并增強其穩定性
通過 BioGRID 數據庫預測并驗證 USP18 與 SOX9 的相互作用，免疫共沉淀和免疫熒光實驗證實兩者在細胞內直接結合并共定位。USP18 敲低加速 SOX9 蛋白降解，而過表達 WT-USP18 延長其半衰期，且蛋白酶體抑制劑 MG132 可逆轉 USP18 敲低導致的 SOX9 減少，表明 USP18 通過泛素 - 蛋白酶體途徑穩定 SOX9。進一步研究發現，USP18 特異性去除 SOX9 的 K48-linked 泛素鏈，而非 K63-linked 鏈，且 SOX9 的 K205 位點是 USP18 介導去泛素化的關鍵位點。
USP18 通過調控 SOX9 影響膠質瘤細胞功能
rescue 實驗表明，在 USP18 敲低的 U87 細胞中過表達 SOX9，可逆轉細胞增殖、遷移和侵襲的抑制，恢復神經球形成能力及干細胞標志物表達；而在 USP18 過表達的 U251 細胞中敲低 SOX9，則抵消 USP18 誘導的惡性表型增強，證實 SOX9 是 USP18 發揮功能的關鍵下游靶點。
USP18/SOX9 軸在體內促進膠質瘤生長
小鼠原位異種移植實驗顯示，USP18 敲低顯著抑制 U87 細胞的顱內腫瘤生長，延長小鼠生存期，而過表達 SOX9 可挽救 USP18 敲低的抑癌效應。在 GSC23 細胞中，WT-USP18 過表達加速腫瘤生長，縮短生存期，而 USP18-C64S 突變體無此作用，敲低 SOX9 同樣逆轉 USP18 過表達的促癌效應。免疫組化分析顯示，USP18/SOX9 軸調控腫瘤組織中干細胞標志物（SOX2、CD133）及增殖標志物 Ki67 的表達，進一步驗證其在體內的功能。
YY1 直接結合 USP18 啟動子促進其轉錄
通過 JASPAR、CistromeDB 等多個轉錄因子預測數據庫篩選出 YY1 作為 USP18 的上游調控因子。臨床數據顯示 YY1 與 USP18 表達呈正相關，敲低 YY1 降低 USP18 的 mRNA 和蛋白水平，過表達則反之。雙熒光素酶報告基因實驗和染色質免疫沉淀（ChIP）實驗證實，YY1 通過結合 USP18 啟動子的 site3 區域增強其轉錄活性，突變該位點可消除 YY1 對 USP18 的調控作用。此外，YY1 敲低抑制 GSCs 的腫瘤球形成能力，而過表達 USP18 可部分逆轉該效應，表明 YY1 通過調控 USP18 影響 GSCs 干性。
研究結論與意義
本研究首次系統揭示了 USP18 在 GBM 中的促癌機制，即通過去泛素化并穩定 SOX9，維持 GSCs 干性并促進腫瘤惡性進展，而轉錄因子 YY1 通過激活 USP18 轉錄形成 YY1/USP18/SOX9 調控軸。該研究不僅為 GBM 的發病機制提供了新見解，還鑒定出 USP18 作為潛在治療靶點的價值，為開發針對 GBM 的靶向治療策略（如 USP18 抑制劑或 YY1 拮抗劑）提供了實驗依據，有望克服當前治療瓶頸，改善患者預后。
