《Cell Death & Disease》：Autophagy- and oxidative stress-related protein deregulation mediated by extracellular vesicles of human MJD/SCA3 iPSC-derived neuroepithelial stem cells and differentiated neural cultures
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【編輯推薦】為探究細胞外囊泡（EVs）在 Machado-Joseph �。∕JD）中傳播致病因子的作用，研究人員從對照（CNT）和 MJD 患者的 iPSC 衍生神經上皮干細胞（NESC）及分化神經培養物中分離 EVs，發現 MJD EVs 可下調自噬和氧化應激相關蛋白，且存在突變 ataxin-3 傳播傾向，為 MJD 病理機制提供新視角。
在神經退行性疾病的研究領域， Machado - Joseph �。� MJD ，又稱脊髓小腦性共濟失調 3 型 SCA3 ）因其復雜的病理機制和缺乏有效治療手段而備受關注。該病由 ATXN3 基因突變導致 ataxin - 3 蛋白多聚谷氨酰胺（polyQ） tract 擴展，引發蛋白錯誤折疊、聚集及神經元死亡。目前，關于 MJD 中病理因子傳播機制，尤其是細胞外囊泡（EVs）在此過程中的作用知之甚少。而 EVs 作為細胞間通訊的重要媒介，已被證實可攜帶與神經退行性疾病病理相關的分子，因此探究 EVs 在 MJD 中的作用對揭示疾病傳播機制和開發新療法至關重要。
葡萄牙科英布拉大學的研究人員針對這一科學問題展開研究，相關成果發表在《Cell Death and Disease》。
研究人員主要運用了以下關鍵技術方法：從人對照（CNT）和 MJD 誘導多能干細胞（iPSC）衍生的神經上皮干細胞（NESC）及分化神經培養物（包含神經元和神經膠質細胞）中，通過差速離心法分離 EVs；利用納米顆粒跟蹤分析（NTA）和透射電子顯微鏡（TEM）對 EVs 的物理特性進行表征；借助蛋白質免疫印跡（Western blot）和逆轉錄聚合酶鏈反應（RT - PCR）檢測 EVs 中自噬、氧化應激相關蛋白及 mRNA 的表達；通過間接共培養模型和免疫熒光染色評估突變 ataxin - 3 在細胞間的傳播情況。
研究結果
1. EVs 的物理表征
從 NESC 和分化神經培養物中分離的 EVs 經 NTA 和 TEM 分析顯示，CNT 和 MJD 來源的 EVs 在粒徑分布和平均尺寸上無顯著差異，但 MJD 神經培養物來源的 EVs 顆粒濃度呈降低趨勢。Western blot 證實 EVs 表達典型標記蛋白 Alix 和 Flotillin - 1，且不含細胞內蛋白 Calnexin，表明成功分離得到 EVs。
2. EVs 的蛋白和 mRNA cargo 分析
Western blot 結果顯示，CNT 和 MJD EVs 均存在自噬相關蛋白 p62、Beclin - 1 及氧化應激相關蛋白 SOD1，但 MJD EVs 中 p62 水平較低，SOD1 水平較高。RT - PCR 檢測到 EVs 中存在自噬相關基因（SQSTM1、BECN1、UBC、ATG12、LC3B）和氧化應激相關基因 CYCS 的 mRNA，但 CNT 與 MJD EVs 之間無顯著差異。此外，僅在少數 MJD NESC - EVs 樣本中檢測到突變 ATXN3 mRNA。
3. EVs 的細胞內化及對受體細胞的影響
CFSE 標記實驗證實 EVs 可被人神經元內化，且孵育后細胞 viability 未受影響。但 MJD EVs（來自 NESC 或分化神經培養物）可導致受體細胞中 SOD1 及自噬相關蛋白（ATG3、ATG7、Beclin - 1、LC3B、p62）水平降低，而 CNT EVs 則傾向于上調 p62 等蛋白。
4. 突變 ataxin - 3 的細胞間傳播
間接共培養模型中，與 MJD 分化神經細胞共培養的 CNT 細胞顯示 ataxin - 3 陽性聚集體數量呈增加趨勢，提示突變 ataxin - 3 可能通過 EVs 或其他可溶性因子在細胞間傳播。
研究結論與討論
本研究首次提供了 MJD 來源 EVs 可介導自噬和氧化應激通路失調的證據，并暗示 EVs 在突變 ataxin - 3 傳播中可能的作用。具體而言，MJD EVs 通過傳遞低水平的自噬相關蛋白和異常的氧化應激信號，干擾受體細胞的穩態，而 CNT EVs 則可能通過上調自噬和抗氧化蛋白發揮保護作用。盡管未直接檢測到突變 ataxin - 3 蛋白在 EVs 中的存在，但其在共培養系統中的傳播趨勢提示需進一步研究 EVs 在 MJD 病理擴散中的具體機制。
該研究不僅加深了對 MJD 病理機制的理解，也為開發基于 EVs 的生物標志物和治療策略提供了新方向，例如通過調節 EVs cargo 來恢復受損的自噬和氧化應激通路，或阻斷 EVs 介導的病理因子傳播。未來研究可進一步探索 EVs 在體內的傳播途徑及長期影響，為 MJD 的臨床干預提供更堅實的理論基礎。
