《Cell Regeneration》：Morphological segmentation with tiling light sheet microscopy to quantitatively analyze the three-dimensional structures of spinal motoneurons
編輯推薦：
脊髓運動神經元（SpMNs）調控肌肉收縮，其多樣性對運動功能至關重要。但產后發育中三維（3D）形態變化研究受限。本研究用平鋪光片顯微鏡（TLSM）結合組織透明化，分析頸、腰脊髓運動神經元胞體大小及樹突分支，發現上肢相關神經元早于下肢分化，為揭示 SpMNs 多樣性提供新視角。
脊髓運動神經元（SpMNs）作為運動指令的最終執行者，在調控肌肉收縮、協調肢體運動中扮演核心角色。然而，這類神經元在產后發育過程中如何形成形態與功能多樣性，長期以來因缺乏高通量三維（3D）成像工具而難以深入解析。傳統的二維組織學評估無法捕捉神經元的空間分布與立體結構動態，導致學界對 SpMNs 在脊髓中的組織模式及其發育規律知之甚少。例如，α 運動神經元（αMNs）與 γ 運動神經元（γMNs）雖在功能上分別支配骨骼肌纖維與肌梭，但它們在產后發育中的形態分化時序、空間分布差異等關鍵問題尚未明確。
為破解這些難題，浙江大學、西湖大學及西湖生命科學與醫學實驗室的研究團隊開展了系統性研究。團隊以 ChAT-eGFP 轉基因小鼠為模型，結合平鋪光片顯微鏡（TLSM）與 CUBIC-L 組織透明化技術，對產后不同階段（P1、P7、P14、P28、P56）頸髓和腰髓的內側運動柱（MMC）與外側運動柱（LMC）神經元進行高分辨率三維成像，并通過腺病毒（AdV）標記技術追蹤支配屈伸肌的運動神經元樹突結構。相關成果發表在《Cell Regeneration》，為解析脊髓運動系統的發育機制提供了關鍵數據。
研究采用的核心技術包括：
- TLSM 成像與組織透明化：利用 TLSM 對厘米級透明化脊髓樣本進行快速 3D 掃描，結合 CUBIC-L 技術消除組織散射，實現亞微米級分辨率成像。
- 半自動分割與深度學習算法：通過 Amira 軟件的深度學習模塊（DL Training-Segmentation 3D）對密集的運動神經元胞體進行半自動分割，結合中值濾波、分水嶺算法等實現單細胞精準識別。
- 腺病毒逆行標記：通過肌肉注射 AdV-eGFP/tdTomato，逆行標記支配脛骨前�。═A，屈�。┖碗枘c肌外側頭（GL，伸�。┑倪\動神經元，結合 3D 體積重建分析樹突分支模式。
胞體大小動態與神經元分化
通過對頸髓和腰髓運動神經元胞體的三維體積分析，研究發現：
- 上肢支配神經元的早期分化：頸髓 LMC 和 MMC 神經元在 P14 時胞體大小分布出現雙峰值，提示分化為大、小兩個亞群（推測分別為 αMNs 和 γMNs），其中小胞體亞群占比約 31%-35%。
- 下肢支配神經元的延遲分化：腰髓運動神經元直至 P28-P56 才出現明顯的雙峰值分布，表明其分化進程晚于頸髓神經元。
- 空間分布異質性：成熟脊髓中，γMNs（小胞體）與 αMNs（大胞體）的空間分布并非均勻混合，而是呈現區域性聚集，暗示其與靶肌肉類型的特異性關聯。
樹突分支的發育模式
利用 AdV 標記技術對單個運動神經元樹突進行追蹤，發現：
- 分支數量的動態變化：無論是屈肌還是伸肌支配的神經元，樹突分支數量隨分級（order）增加先升后降，第 4-5 級分支密度最高，表明樹突在中遠端區域形成主要計算單元。
- 長度與彎曲度的調控：TA 神經元樹突長度在 P4-P14 顯著增長，P14 后趨于穩定；GL 神經元則持續增長至 P56。而樹突彎曲度（tortuosity）在發育過程中無顯著變化，提示其形態穩定性。
- 功能與代謝的平衡：樹突結構的復雜性體現了突觸輸入整合與代謝成本的優化，成熟神經元的樹突架構已接近成年模式，為運動控制的精準性奠定基礎。
研究結論與意義
本研究首次通過高通量三維成像與定量分析，揭示了脊髓運動神經元產后發育的時空規律：上肢相關神經元通過胞體大小分化優先建立功能特化，下肢神經元則伴隨運動需求延遲成熟。樹突分支的動態調控表明，神經元通過優化分支結構增強信號處理效率。這些發現不僅為理解運動系統的發育編程提供了形態學證據，也為肌萎縮側索硬化（ALS）等選擇性累及 αMNs 的神經退行性疾病提供了新視角 —— 例如，αMNs 的大胞體特性可能與其高代謝需求和易損性相關。
研究建立的 TLSM 聯合組織透明化、半自動分割等技術體系，為中樞神經系統神經元的高通量形態分析提供了標準化方案。未來結合分子標記與電生理技術，可進一步解析 γMNs 與 αMNs 的功能異質性，深化對運動控制與疾病機制的理解。
