《Extracellular Vesicle》：Engineering ARMMs for improved intracellular delivery of CRISPR-Cas9
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CRISPR-Cas9 基因編輯極具治療潛力，但遞送效率低限制其應用。研究人員探索 ARRDC1 介導的微泡（ARMMs）遞送 CRISPR-Cas9 的潛能。結果顯示 ARMMs 可高效遞送，顯著降低神經元中致病淀粉樣肽。這為基因治療帶來新希望。
在基因治療的前沿領域，CRISPR-Cas9 技術宛如一顆璀璨的新星，為攻克各種人類疑難病癥帶來了前所未有的希望。它能夠像一把精準的 “基因剪刀”，對基因進行精確的修飾，無論是修正致病的基因突變，還是插入治療性基因，又或是刪除有害的基因序列，都不在話下。比如在治療鐮狀細胞貧血和 β- 地中海貧血時，CRISPR-Cas9 就像一位技藝高超的 “基因修復師”，重新激活胎兒血紅蛋白的生成，彌補成人血紅蛋白的缺陷，為這些疾病的治愈開辟了新途徑；在癌癥治療的戰場上，經過 CRISPR 編輯的 T 細胞搖身一變成為了勇猛的 “抗癌戰士”，增強了識別和摧毀癌細胞的能力。然而，這把 “基因剪刀” 在實際應用中卻遇到了重重阻礙。其中，如何將 CRISPR-Cas9 高效地遞送到目標細胞，成為了橫亙在科學家面前的一座大山�，F有的遞送方法，像病毒載體雖然能靶向特定組織，但它的 “載貨量” 有限，無法攜帶更多的基因元件；脂質納米顆粒雖然能包裹較大的基因載荷，卻可能對細胞產生毒性，引發炎癥反應；電穿孔技術在體外應用時效果不錯，可它就像一把 “雙刃劍”，在導入 CRISPR 組件的同時，也會對細胞造成嚴重的損傷；核糖核蛋白（RNP）復合物雖然能減少脫靶效應和免疫反應，可在體內遞送時卻因效率和穩定性問題而舉步維艱。
面對這些困境，科研人員們沒有放棄，他們不斷探索新的解決方案。在這樣的背景下，來自未知研究機構的研究人員開展了一項旨在探索新型 CRISPR-Cas9 遞送平臺的研究。他們將目光聚焦在了一種名為 ARRDC1 介導的微泡（ARMMs，一種在細胞膜形成的細胞外囊泡）上，試圖利用它來包裝和遞送 CRISPR-Cas9 復合物。研究人員通過一系列巧妙的實驗設計和技術手段，最終發現 ARMMs 能夠有效地將 CRISPR-Cas9 復合物遞送到細胞內，并且在多種細胞類型中展現出了強大的基因編輯能力。這一研究成果發表在《Extracellular Vesicle》上，為基因治療領域帶來了新的曙光。
研究人員在開展這項研究時，運用了多個關鍵技術方法。首先是細胞培養技術，培養了包括 HEK293T 細胞、U2OS-gfp 細胞、ReNcell? CX 人類神經祖細胞系和人類誘導多能干細胞衍生的谷氨酸能神經元（iPSC-GlutaNeurons）等多種細胞。其次是基因編輯技術，構建靶向 eGFP 和人類 APP 的單導向 RNA（sgRNA）并導入相關載體。此外，還運用了蛋白質分析技術，如免疫印跡分析檢測相關蛋白；以及基因測序技術，像 Sanger 測序和深度測序分析基因編輯情況 。
下面來看具體的研究結果：
- CRISPR-Cas9 復合物的包裝：研究人員構建了兩種融合構建體，將 ARRDC1 連接到 Cas9 的 N 端，一種是帶有全長 ARRDC1 的 A1-Cas9，另一種是帶有截短版本 ARRDC1（僅保留囊泡出芽所需的基本結構域）的 sA1-Cas9。實驗結果令人驚喜，這兩種融合構建體都保留了與未修飾 Cas9 相當的基因編輯活性，而且通過納米顆粒跟蹤分析和蛋白質免疫印跡分析發現，它們都能促進 Cas9 包裝進入 ARMMs，其中 sA1-Cas9 的包裝效率更勝一籌。
- VSV-G 假型化的 ARMMs 包裝 CRISPR-Cas9：研究人員嘗試用 VSV-G 對 ARMMs 進行假型化處理，以進一步提高其包裝和遞送效率。他們發現，隨著 VSV-G 濃度的增加，細胞外囊泡（EVs）的出芽數量呈現出劑量依賴性的增加，而且 Cas9 的包裝效率也顯著提高。在優化 VSV-G 濃度后，sA1-Cas9 與 5% VSV-G 的組合實現了最高的包裝效率，每個囊泡中大約能包裝 1000 個 Cas9 分子。
- ARMMs 在 U2OS 細胞中遞送 CRISPR-Cas9：研究人員將包裝有 Cas9/sgRNA 復合物且靶向 GFP 基因的 ARMMs 與含有單個 GFP 基因拷貝的 U2OS 細胞共同孵育。通過檢測 GFP 表達的變化來衡量基因敲除效率，結果發現，與未處理的對照組相比，孵育后 GFP 陰性細胞顯著增加。特別是當使用 5% VSV-G 進行假型化處理時，sA1-Cas9 的編輯效率更高。同時，Western blotting、T7E1 分析和直接 DNA 測序都證實了 ARMMs 能夠成功將 Cas9 遞送到受體細胞并實現基因編輯。
- 通過 ARMMs 遞送在人類神經元細胞中進行基因編輯：研究人員以人類神經元細胞為研究對象，選擇了與神經退行性疾病密切相關的 APP 基因為靶點。他們用包裝有 Cas9/sgRNA 的 ARMMs 孵育人類神經祖細胞 ReNcell CX 和人類 iPSC 衍生的神經元，通過多種檢測方法發現，ARMMs 能夠有效地遞送到這些細胞中，實現高效的基因編輯，并且顯著降低了淀粉樣 β 肽（Aβ40 和 Aβ42）的濃度。同時，研究還發現 ARMMs 介導的基因編輯在預測的脫靶位點未觀察到編輯現象，表明其具有較好的特異性。
綜合研究結果和討論部分，這項研究意義重大。它首次證實了 ARMMs 可以作為一種高效的 CRISPR-Cas9 遞送平臺，通過直接將 ARRDC1 與 Cas9 融合，簡化了傳統的遞送系統，提高了包裝效率。截短版本的 ARRDC1 進一步增強了囊泡出芽和包裝效率，而 VSV-G 假型化處理則顯著提升了 Cas9 的包裝和遞送能力。在人類神經元細胞中對 APP 基因的成功編輯，為神經退行性疾病的治療提供了新的策略和希望。雖然目前研究還存在一些局限性，如需要進一步在體內評估其效率和安全性，明確 VSV-G 增強 Cas9 包裝的機制以及優化針對不同基因靶點的引導 RNA 等，但這無疑為基因治療領域的發展奠定了堅實的基礎，開啟了新的研究方向。
