《Brain, Behavior, and Immunity》：Dysfunction of cholinergic neuron in nucleus ambiguous aggravates sepsis-induced lung injury via a GluA1-dependment mechanism
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為探究外周炎癥對迷走神經節前神經元的影響，遵義醫科大學研究人員開展 “膿毒癥致肺損傷” 相關研究。結果發現膿毒癥會誘導疑核（NA）膽堿能神經元凋亡，經 GluA1 機制加重肺損傷。這為膿毒癥多器官衰竭治療提供新方向。
論文解讀
在醫學領域，膿毒癥一直是一個令人談之色變的 “殺手”。它可不是簡單的感染，而是因宿主免疫系統對感染反應失調，進而引發器官功能障礙，嚴重時會危及生命。膿毒癥相關腦�。⊿AE）作為其并發癥，常伴隨著大腦功能的急性和長期異常。以往對 SAE 的研究多聚焦于認知功能、譫妄等方面，但近年來一系列臨床和神經病理學觀察發現，膿毒癥患者可能存在腦干功能障礙，而這一發現或許能解釋為何膿毒癥患者死亡率居高不下。
腦干，雖體積不大，卻掌控著人體諸多關鍵生理活動。它包含呼吸中心、心血管中心和自主神經中心，這些中心通過發出纖維支配交感、副交感和迷走神經，將心血管、呼吸和免疫系統緊密聯系在一起。然而，腦干在許多神經系統疾病中卻十分脆弱，比如無菌性肺損傷或注射脂多糖（LPS）后，腦干中促炎細胞因子增加，就會影響中樞自主神經和呼吸回路的功能。
此外，迷走神經在神經免疫交流中扮演著重要角色。它能通過傳入神經纖維感知外周炎癥，將信號傳遞到大腦，再經傳出神經纖維反射性調節免疫反應，這一過程被稱為 “炎癥反射”。其中，炎癥反射的傳出臂，也就是 “膽堿能抗炎通路（CAP）”，由腦膽堿能核、傳出迷走神經和外周 α7 煙堿型乙酰膽堿受體（α7nAchRs）組成。已有研究表明，刺激傳出迷走神經能減輕大鼠缺血 / 再灌注損傷后因高容量通氣策略引發的急性肺損傷。
但是，外周炎癥究竟如何影響迷走神經節前神經元，進而影響膽堿能抗炎通路和呼吸功能，仍是未解之謎。為了揭開這些謎團，遵義醫科大學的研究人員展開了深入研究。他們的研究成果發表在《Brain, Behavior, and Immunity》雜志上，為膿毒癥的治療提供了新的方向。
研究人員在此次研究中使用了多種關鍵技術方法。在動物實驗方面，選用成年雄性 C57BL/6 小鼠、ChAT-IRES-Cre 小鼠與 Rosa26R-tdTomato 小鼠雜交產生的 ChAT-cre-Ai14 小鼠 ，通過盲腸結扎穿孔（CLP）手術構建膿毒癥模型。運用全身體積描記系統測量小鼠呼吸活動；借助免疫熒光技術檢測相關蛋白表達；采用 H&E 染色評估肺損傷情況；利用電生理學方法記錄神經元電活動；通過立體定位注射、光纖植入、套管植入等技術進行藥物干預和信號監測；運用鈣光纖光度法記錄谷氨酸和鈣離子熒光信號；還使用神經接口處理器記錄迷走神經放電情況。
下面我們來看看具體的研究結果：
- 膿毒癥導致呼吸功能下降和疑核膽堿能神經元凋亡：研究人員對膿毒癥小鼠模型進行研究，通過對延髓腹外側切片進行 caspase-3 免疫熒光檢測，發現 CLP 術后 24 小時和 48 小時，延髓腹外側神經元中 caspase-3 表達顯著增加，尤其是疑核（NA）中的膽堿能神經元。細胞計數顯示，術后 48 小時神經元數量明顯減少。進一步通過 ChAT 和 caspase-3 共染色，證實了外周炎癥可誘導 NA 膽堿能神經元凋亡。同時，記錄迷走神經放電發現，CLP 術后 24 小時和 48 小時，迷走神經放電頻率顯著降低。利用全身體積描記系統記錄呼吸功能并對肺組織進行 H&E 染色后發現，與對照組相比，CLP 術后 24 小時和 48 小時的小鼠呼吸頻率、潮氣量（VT）、分鐘通氣量（MV）、吸氣峰流速（PIF）、呼氣峰流速（PEF）和 EF50 均顯著下降，肺損傷評分顯著升高，表明膿毒癥會導致呼吸功能受損和肺炎癥。
- 疑核膽堿能神經元的條件性缺失抑制迷走神經介導的抗炎作用：為探究 NA 中膽堿能神經元凋亡對迷走神經放電頻率和抗炎作用的影響，研究人員通過向 ChAT-Cre 小鼠的 NA 單側微注射 AAV-DIO-DTA，條件性刪除膽堿能神經元。結果顯示，與對照組相比，ChATDTA組的 PEF、EF50、VT 和 MV 顯著降低；CLP 手術后，CLP-ChATDTA組的 PIF、呼吸頻率、VT 和 MV 顯著低于 CLP-ChATcon組。H&E 染色顯示，ChAT-DTA 和 CLP-ChATDTA組肺組織出現炎癥，且這兩組的迷走神經放電頻率明顯下降。這表明 NA 中的膽堿能神經元在呼吸功能中起關鍵作用，且膽堿能抗炎作用由迷走神經介導。
- 谷氨酸積累可能誘導膽堿能神經元的興奮性毒性：研究人員通過制備包含 NA 的延髓切片，進行全細胞 patch-clamp 記錄，評估神經元興奮性。結果發現，CLP 術后 6 小時小鼠的 NA 神經元靜息膜電位（RMP）顯著高于對照組，誘發動作電位（AP）所需的閾值電流顯著低于對照組，相同去極化電流誘導的 AP 數量顯著高于對照組，表明 CLP 術后 NA 神經元興奮性明顯增加。進一步研究發現，CLP 術后小鼠 NA 神經元的自發興奮性突觸后電流（sEPSCs）頻率明顯增加，但幅度無變化。通過病毒注射記錄谷氨酸熒光強度，發現 CLP 術后谷氨酸積累增加。此外，染色結果顯示，CLP 模型組的小膠質細胞和星形膠質細胞數量顯著增加，且聚集在疑核周圍。由此推測，小膠質細胞和星形膠質細胞的積累可能是疑核附近谷氨酸增加的原因之一。
- GluA1 而非 GluA2 介導神經元興奮性毒性：通過全細胞 patch-clamp 記錄 AMPAR-sEPSCs 和 NMDAR-sEPSCs，研究人員發現 CLP 組的 AMPAR-sEPSCs 幅度和頻率均顯著增加，而 NMDAR-sEPSCs 數量無明顯變化，表明 NA 膽堿能神經元興奮性增加由 AMPARs 介導。免疫熒光檢測發現，與對照組相比，CLP24 小時組的 GluA1 表達顯著增加，但 GluA2 無明顯變化。通過微注射 AAV-DIO-GCamps 并植入光纖記錄鈣離子信號，發現 CLP 術后 Ca2+信號的平均 ΔF/F0和峰值 ΔF/F0均顯著升高。由此推測，CP-AMPARs 上調及其生物放大效應觸發 Ca2+內流興奮性毒性信號通路，可能導致細胞死亡。
- 特異性阻斷 GluA1 部分挽救迷走神經放電和呼吸功能：為證實 GluA1 上調導致的 NA 膽堿能神經元凋亡會加重肺損傷，研究人員向 NA 微注射 IEM1460（一種選擇性阻斷 GluA2 缺失的 AMPARs 的藥物）。結果顯示，與載體對照組相比，IEM1460 組膿毒癥動物的 MV 顯著改善，其他呼吸參數有改善趨勢，肺組織 H&E 染色顯示炎癥反應顯著降低，迷走神經記錄顯示放電頻率增加。這表明特異性阻斷 GluA1 可部分挽救迷走神經放電并改善呼吸功能。
綜合上述研究結果，研究人員得出結論：膿毒癥通過含有 GluA1 的 AMPAR 介導 NA 中膽堿能神經元的興奮性毒性，引發腦干迷走神經呼吸成分的顯著變化。這一發現為理解和治療膿毒癥中危及生命的多器官衰竭提供了新的視角，有助于開發針對膿毒癥的更有效治療策略，在膿毒癥研究領域具有重要意義。不過，該研究也存在一定局限性，比如未明確谷氨酸積累的具體來源，未來還需進一步探究小膠質細胞和星形膠質細胞在 CLP 術后谷氨酸積累中的作用。但這并不影響此次研究成果為后續研究指明方向，期待未來能有更多突破，攻克膿毒癥這一醫學難題。
