《Cell Reports》：A multimodal screening platform for endogenous dipeptide repeat proteins in C9orf72 patient iPSC neurons
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本文構建了用于檢測 C9orf72 患者誘導多能干細胞（iPSC）神經元中內源性二肽重復蛋白（DPRs）的多模態篩選平臺。通過該平臺發現了調控 DPRs 的小分子和基因，為肌萎縮側索硬化（ALS）和額顳葉癡呆（FTD）等疾病研究提供新思路。
研究背景
短串聯重復序列的擴增與多種神經退行性和神經肌肉疾病相關，如肌萎縮側索硬化（ALS）、額顳葉癡呆（FTD）等。C9orf72 基因內含子 1 中的 G4C2六核苷酸重復擴增是 ALS 和 FTD 最常見的遺傳病因，通過重復相關非 AUG（RAN）翻譯產生的二肽重復蛋白（DPRs）在中樞神經系統組織中積累，具有神經毒性。目前對 DPRs 的研究存在諸多挑戰，如現有遺傳篩選研究未在 DPRs 的內源性環境中進行，患者來源的 iPSC 神經元中內源性 DPRs 檢測困難，限制了高通量篩選。因此，開發在 iPSC 神經元中對 C9orf72 DPRs 進行高通量篩選的方法至關重要。
研究方法
- 構建 C9orf72 患者 i3N DPReporter 細胞系：利用 CRISPR - Cas9 技術，將編碼熒光報告基因 NLS - mApple 和強力霉素誘導型神經生成素 2（NGN2）的表達盒整合到攜帶約 700 個重復的患者細胞系的 CLYBL 安全港位點，構建 C9orf72 患者 i3N 親代細胞系。之后，將 HiBiT 標簽插入到 i3N 患者細胞系中 GGGGCC 重復擴增下游的 polyGA 或 polyGP 閱讀框中，生成 “DPReporter” 細胞系。
- 高通量小分子篩選：優化培養條件和 384 孔板格式的發光檢測，用 C9orf72 反義寡核苷酸（ASO）處理確認檢測 DPR - HiBiT 水平的可靠性，優化熒光毒性檢測與熒光素酶檢測的多重檢測。用核苷類似物地西他濱處理驗證報告細胞系檢測 DPR 調節劑的能力，對包含 1444 種化合物的天然產物文庫進行高通量篩選。
- 研究小分子 Periplocin 對 DPR 周轉的影響：開發活細胞內源性 DPRs 的活標記方案，通過 HiBiT 發光跟蹤其降解。研究 Periplocin 對未折疊蛋白反應（UPR）和 ERK1/2、AMPK 激活的影響，用 MEK1/2 抑制劑曲美替尼預處理細胞，觀察對 DPR 水平的影響，并在 C9orf72 果蠅模型中驗證。
- CRISPRn 篩選人類解旋酶：進行包含所有 95 種人類解旋酶和 58 種含解旋酶結構域基因的 CRISPR - Cas9 敲除（CRISPRn）篩選，優化實驗條件，用 3 個引導 RNA 和重組 SpCas9 蛋白轉染 i3N GA - HiBiT 細胞，進行成像和發光 / 毒性檢測，確定影響 DPR 表達的基因。
研究結果
- C9orf72 患者 i3N DPReporter 細胞系的特性：DPReporter 細胞系能靈敏、快速地檢測裂解細胞和活細胞中的內源性 DPRs，其發光信號比未標記的親代細胞系高 20 - 130 倍，且信號特異性得到驗證。對細胞系進行詳細分析，包括 C9orf72 sense 和 antisense 重復 RNA 焦點、antisense RNA 轉錄本、多能性標記物的表達，以及基因組完整性、重復長度等檢測，確定 i3N GA - HiBiT 細胞系適合用于篩選。
- 高通量小分子篩選結果：篩選確定了 25 種降低 DPR 水平和 31 種增加 DPR 水平且無毒性的化合物，72 小時和 120 小時處理的篩選結果相關性高（r2 = 0.78，p < 0.0001）。確定 Periplocin 為內源性 polyGA 和 polyGP 水平的增強劑，其能濃度依賴性地增加 DPR 水平，且在未編輯的患者 iPSC 衍生細胞系中得到驗證。
- Periplocin 的作用機制：Periplocin 抑制 DPR 周轉（t1/2DMSO = 36 h，t1/2periplocin > 96 h），可能通過激活 ERK1/2 通路增加 DPR 水平。在 C9orf72 果蠅模型中，曲美替尼處理可降低 ERK 磷酸化和 polyGP 水平，延長果蠅壽命。
- CRISPRn 篩選結果：CRISPRn 篩選確定了 15 種敲除后降低 polyGA - HiBiT 水平的基因，其中 5 種基因（ERCC8、RECQL、RECQL4、RTEL1 和 UPF1）對全局翻譯無影響，具有增強的對 RAN 翻譯的特異性。STRING 分析和文獻挖掘發現，4 種解旋酶（RECQL、RECQL4、RTEL1 和 UPF1）與端粒穩態和維持功能相關，且敲低這些解旋酶可降低 DPR 水平。
研究結論
本研究建立了基于熒光素酶的高通量篩選方法，可用于研究 iPSC 衍生神經元中內源性 C9orf72 DPR 水平的調節劑。HiBiT 標簽的使用有助于在其他重復擴增疾病中研究內源性 RAN 翻譯蛋白。發現 Periplocin 可調節 DPR 表達，其作用機制與 ERK1/2 激活有關，且在果蠅模型中得到驗證，為 C9FTD/ALS 的治療提供了潛在的藥物靶點。CRISPRn 篩選確定了端粒相關解旋酶可調節 DPR 表達，揭示了端粒和 C9orf72 重復序列調控的重疊性。但研究存在局限性，如無法確定 HiBiT 標記的 DPRs 是否為純的，也不能立即區分 DPR 與 RNA 的毒性。未來可進一步研究這些問題，為相關疾病的治療提供更多思路。
