《npj Viruses》：Kinetic MUNANA assay reveals functionally relevant antibody epitopes on Influenza A virus neuraminidase
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甲型流感病毒（IAV）持續威脅公眾健康，現有疫苗針對血凝素（HA）效果不一。研究人員開展了以神經氨酸酶（NA）為靶點的研究，用動力學 MUNANA 檢測和 ELLA 分析抗 NA 單克隆抗體（mAbs），發現部分 mAbs 靶向功能重要的 NA 表位，為流感疫苗開發提供新方向。
在流感病毒的世界里，甲型流感病毒（IAV）一直是人類健康的大敵。它就像一個狡猾的 “變色龍”，不斷進行抗原漂移，每年都變換著新的 “面孔” 出現，給人們帶來一波又一波的流感疫情。目前，大規模接種疫苗是減輕流感爆發危害的主要手段，但現有的疫苗大多以病毒表面的主要糖蛋白血凝素（HA）為靶點，其效果卻參差不齊。這就好比用一把不太精準的 “鑰匙” 去開流感病毒這把不斷變化的 “鎖”，有時候能打開，有時候卻不行。
而神經氨酸酶（NA）作為 IAV 的第二大表面糖蛋白，逐漸進入了科研人員的視野。一些低分子量的 NA 抑制藥物，在控制病毒感染和緩解癥狀方面表現出色，這讓人們看到了以 NA 為靶點開發疫苗的希望。然而，針對不同表位的抗 NA 抗體在宿主保護中的作用還不太清楚，NA 的抗原位點也沒有被清晰地描述。就好像在一個未知的地圖上尋找寶藏，科研人員還沒有找到準確的路線。
在這樣的背景下，來自瑞典哥德堡大學（University of Gothenburg）的研究人員決心踏上探索之旅。他們開展了一項研究，旨在通過動力學 MUNANA 檢測和 ELLA（酶聯凝集素測定）等技術，深入了解抗 NA 單克隆抗體（mAbs）對 NA 酶活性的影響，并確定這些 mAbs 的結合位點和功能意義。
研究人員首先制備了針對廣泛使用的 PR8 H1N1 毒株 NA 的一系列 mAbs。他們就像一群技藝精湛的工匠，精心培育出這些 mAbs。然后，利用 ELISA（酶聯免疫吸附測定）等多種檢測方法，對 mAbs 的免疫反應性進行評估，發現不同的 mAbs 與 NA 的結合能力和結合位點各不相同。
接著，通過動力學 MUNANA 檢測，研究人員發現不同的抗 NA mAbs 對 NA 酶活性有著多樣的影響。有的 mAbs 像 NPR - 05，能增強酶活性，是混合型抑制劑；有的如 NPR - 07，表現出競爭性抑制；NPR - 11 則屬于非競爭性抑制，降低了 NA 的整體催化活性。這就像給 NA 這個 “小機器” 換上了不同的 “零件”，導致它的工作方式發生了變化。
為了進一步確定 mAbs 的結合位點，研究人員通過篩選病毒逃逸突變體進行研究。結果發現，NPR - 05 和 NPR - 07 能夠選擇出逃逸突變體，這些突變體的氨基酸替換發生在靠近 NA 活性位點的區域。這表明這兩種 mAbs 靶向的是功能相關的 NA 表位，這些表位就像 NA 這個 “機器” 上的關鍵 “按鈕”，一旦被 mAbs 按下，就會影響病毒的功能。
對逃逸突變體的功能分析顯示，這些突變體的酶活性和病毒適應性都發生了改變。大多數突變體的生長速度比野生型 PR8 慢，病毒粒子從唾液酸的釋放也減少了。這說明 NPR - 05 和 NPR - 07 所針對的表位在病毒的復制和傳播過程中起著重要作用。
這項研究的意義重大。它為抗 NA mAbs 的功能表征提供了新的方法和思路，就像為科研人員在探索流感病毒的道路上點亮了一盞明燈。通過結合 ELLA 和動力學 MUNANA 檢測，能夠更全面地了解 mAbs 對 NA 活性的抑制機制，有助于篩選出更有效的抗流感病毒 mAbs，為開發更高效、更持久的流感疫苗奠定了基礎。而且研究人員開發的網絡應用程序，方便了數據處理和統計分析，也為其他科研人員提供了便利的工具。論文發表在《npj Viruses》上，為全球的流感研究領域注入了新的活力。
研究人員在開展研究時，用到了以下幾個主要關鍵技術方法：首先是制備多種 mAbs，并利用 ELISA 檢測其免疫反應性；然后運用動力學 MUNANA 檢測分析 mAbs 對 NA 酶活性的影響；通過篩選病毒逃逸突變體來確定 mAbs 的結合位點；還使用病毒拯救、噬斑減少試驗等對突變體進行功能評估。
研究結果如下：
- 抗 NA mAbs 結合不同抗原位點：研究人員成功制備了 13 種針對 PR8 病毒 NA 的 mAbs，其中 6 種 IgG2a mAbs 與病毒粒子反應性較強。通過競爭 ELISA 發現，這些 mAbs 結合在 NA 表面的三個抗原位點上，不同位點的 mAbs 相互抑制情況不同。
- 抗 NA mAbs 對 NA 酶活性的多樣影響：動力學 MUNANA 檢測顯示，不同 mAbs 對 NA 酶活性影響各異，可分為混合型、競爭性、非競爭性和 steric 抑制等不同類型，且與競爭 ELISA 結果并不完全相關。
- NPR - 05 和 NPR - 07 結合位點及功能驗證：篩選出 NPR - 05 和 NPR - 07 的逃逸突變體，確定其結合位點靠近 NA 活性位點。這些突變體的酶活性和病毒適應性改變，表明這兩種 mAbs 靶向功能重要的 NA 表位。
研究結論和討論部分指出，結合 ELLA 和動力學 MUNANA 檢測可對 mAbs 進行初步分類，確定其抑制機制。功能性抑制劑可能提供更持久的免疫力，因為針對功能關鍵區域的 mAbs 可能對 IAV 逃逸施加更大的進化限制。雖然該假設還需進一步驗證，但動力學 MUNANA 檢測有望成為篩選可能驅動逃逸突變體選擇的 mAbs 的預篩選工具。這項研究為未來流感疫苗開發和抗流感病毒 mAbs 的研究提供了重要的理論基礎和研究方向，具有深遠的意義。
