研究背景

實驗設計

實驗結果

1. HESCs 向 NPCs 分化過程中的 DNA 去甲基化：通過 ATAC-Me 和 RNA-seq 實驗，研究人員發現，在 NPC 誘導后的動態 ChrAcc 區域內存在廣泛的 DNAme 變化。在總共 101,215 個可及位點中，38,189 個顯示出動態可及性趨勢，這些動態區域主要位于內含子和基因間區域，而啟動子區域的可及性相對穩定。與終末分化的造血細胞數據不同，在該模型系統中，動態 ChrAcc 區域內捕獲到大量 DNAme 變化，且 ChrAcc 變化是雙向的，而 DNAme 變化大多是單向的，多數早期低甲基化區域即使染色質關閉仍保持低甲基化，大多數開放位點失去而非獲得 DNAme。
2. ChrAcc 的無監督聚類分析：對 38,189 個動態區域進行無監督聚類分析，根據歸一化讀數計數確定了 7 個聚類，這些聚類可分為 “開放”“關閉” 和 “瞬時” 三大類。不同聚類與特定的時間點相關，反映出染色質對分化信號的快速和瞬時響應。每個動態可及性聚類都與特定的基因本體相關，例如早期事件與循環系統發育的負調控有關，瞬時事件與神經元分化有關，晚期事件與前腦和大腦皮層發育有關。此外，動態區域與 18-state chromHMM 注釋的增強子和抑制子狀態注釋有大量重疊，且在分化過程中，不同區域的染色質狀態會發生顯著轉換。同時，通過基序富集分析發現，不同的 TF 基序與特定的可及性聚類相關，例如 OCT4/SOX2/NANOG 在關閉區域富集，PAX6 在晚期開放區域富集。
3. DNAme 動態與 ChrAcc 的時間差異：量化每個可及性組內區域的總 DNAme 發現，染色質和轉錄變化在誘導后 6 h 就開始，而顯著的 DNAme 變化直到 48 h 才出現。在動態可及性區域中，許多區域的 DNAme 變化與 ChrAcc 變化 “一致”，即 DNAme 減少伴隨 ChrAcc 增加，但 DNAme 損失的最大幅度發生在 2 - 6 天，這導致一些區域在基因調控激活期間處于 “不一致” 狀態，即開放且甲基化。此外，DNAme 的增加較少見，即使染色質關閉，一些區域仍繼續去甲基化，形成另一種 “不一致” 的表觀遺傳狀態，即不可及且低甲基化。通過全基因組 6 堿基測序驗證，發現 DNAme 測量結果與 ATAC-Me 數據高度相關，進一步證實了這些結論。同時，基因表達變化與 ChrAcc 的相關性比與 DNAme 更緊密，表明 DNAme 與 ChrAcc 和基因表達變化存在解耦現象。
4. 增強子去甲基化與 TF 結合的關系：利用 ATAC-Me 文庫中的 Tn5 切割位點頻率進行 TF 足跡分析，以估計動態可及性區域的 TF 占用情況。結果發現，TF 結合位點通常是低甲基化且可及的，但 30% 的可及區域在 12 天的時間內會發生 TF 結合和 DNAme 水平的轉變。對于失去 TF 結合的位點，低甲基化狀態在結合位點丟失后仍長期維持；而對于獲得 TF 結合位點的區域，DNAme 的損失似乎在 TF 結合之前或同時開始，并在結合事件后繼續減少。這表明去甲基化活動在可檢測到的 TF 結合之前就開始，并且在檢測到 TF 足跡后才完成去甲基化過程。
5. 5-hmC 在增強子去甲基化中的作用：在 NPC 分化過程中，TET1 和 TET3 在整個時間過程中高表達，TET2 及其輔因子 IDAX 在 48 h 左右顯著上調，與大量去甲基化的開始時間一致。同時，全局 5-hmC 水平在分化過程中顯著增加，在 4.5 天達到峰值，然后在 12 天降至接近基線水平。通過實驗發現，5-hmC 水平在細胞周期的 G2 期最高，且與 DNA 含量密切相關，表明存在連續的主動去甲基化機制將 5-hmC 轉化為胞嘧啶。對動態可及性區域的 5-hmC 進行核苷酸分辨率的量化分析發現，5-hmC 的增減與可及性變化密切相關，且在去甲基化之前 5-hmC 水平會增加，之后隨著去甲基化過程的進行而降低。此外，5-hmC 高的區域在動態可及性聚類中富集，并且特定的 TF 在這些區域中富集。通過對含有 BHLHA15 根基序的動態區域分析發現，在 TF 結合之前，5-hmC 就開始積累，這表明 5-hmC 可能預測關鍵增強子的可及性變化和 TF 結合。
6. 基于 DNAme 狀態預測 ChrAcc 模式：研究人員開發了一種機器學習方法，利用 XGBoost 分別對 5-mC、5-hmC 和 5-mC + 5-hmC 進行訓練，以預測過去、現在和未來的 ChrAcc。結果發現，訓練和測試于非定向 ChrAcc 區域的模型表現更好，這可能與非定向區域中富含 CpG 密集的啟動子區域和其他 CpG 島，其穩定的甲基化狀態能高度預測穩定的 ChrAcc 狀態有關。對于動態區域，訓練于 4 天甲基化數據的模型在預測 ChrAcc 程度時表現最佳，其中 5-mC 和 5-hmC 對模型的貢獻不同，5-hmC 在后期時間點對模型的貢獻更大。這表明考慮時間和 DNAme 狀態的組合對于理解 DNAme 與 ChrAcc 之間的關系以及它們在調控轉錄中的聯合作用至關重要。

研究討論

1. 研究結果對傳統觀點的挑戰：本研究結果挑戰了教科書上關于 DNAme 在基因調控中作用的模型。以往研究發現，在終末細胞分化過程中，盡管有強烈的 ChrAcc 和轉錄變化，但增強子去甲基化卻很少；同時，穩態 ChrAcc 和 DNAme 數據顯示，可及的增強子可以處于無核小體狀態，且 DNAme 水平多樣，包括高甲基化。這些現象表明，DNAme 與 ChrAcc 和轉錄之間的關系并非如傳統認為的那樣緊密。本研究通過對增殖性 NPCs 的長時間研究，發現 DNAme 變化與 ChrAcc 和轉錄的解耦現象仍然存在，說明這種不一致性并非由細胞的增殖或發育狀態導致。
2. 5-hmC 在去甲基化過程中的作用機制：過去的研究未區分 5-mC 和 5-hmC，無法精確確定去甲基化相對于 ChrAcc 的起始和完成時間。本研究利用密集采樣的 ATAC-Me 數據和 6 堿基測序，發現隨著增強子經歷 ChrAcc 和 TF 結合的波動，5-hmC 在過程早期出現，但在后期才被完全轉化。這種時間上的分離導致了單個時間點上的不一致表觀遺傳狀態。結構研究表明，TET1/2 對 5-mC 的催化效率高于 5-hmC，這可能解釋了為什么維生素 C 處理能增加有絲分裂和無絲分裂細胞中的 DNAme 損失，因為它可能加速了氧化的 5-mC 底物的轉化。此外，5-hmC 可能具有除作為甲基中間體外的其他功能，例如其積累可能預測增強子的可及性變化和 TF 結合。
3. TF 結合與去甲基化的關系：雖然許多 TF 被認為對 DNAme 不敏感，但它們的結合位點最終顯示出低 DNAme 水平。本研究發現，在預測的 TF 結合事件之前，甲基化就開始丟失，并且 5-hmC 在局部積累，隨后逐漸減少。這表明去甲基化至少與 TF 結合同時開始，并且 TF 可能結合這些羥甲基化位點，促進去甲基化的完成，同時激活相關基因的轉錄。
4. 去甲基化的機制和維持低甲基化狀態的原因：在增殖細胞中，增強子去甲基化可能通過 TET 介導的主動機制和復制介導的被動機制共同實現。本研究發現，在 12 天的 9 個時間點中，存在一個特定的窗口，在此期間 DNAme 損失最大，這與 TET2 表達增加和 5-hmC 水平峰值相吻合。同時，5-hmC 水平與 DNA 含量相關，表明其不是通過被動稀釋來轉化，而是通過連續的主動去甲基化機制轉化為胞嘧啶，但具體的轉化機制尚不能確定。此外，除了失去 DNAme，很少有 ChrAcc 區域獲得甲基化，這種主要的甲基化損失在開放和關閉區域都持續存在。對于停用的增強子，其長期低甲基化狀態的維持機制尚不清楚，可能與能夠結合核小體 DNA 的抑制性 TF、排除甲基轉移酶或兩者都有關。
5. 研究的局限性和未來研究方向：本研究使用的 ATAC-Me 技術目前無法區分 5-mC 和 5-hmC，未來開發將 ATAC-seq 與 6 堿基測序相結合的協議，將能夠更直接地分析 5-hmC 動態變化與 ChrAcc 變化之間的時間關系。此外，本研究依賴 Tn5 切割位點頻率間接確定 TF 結合動力學，這依賴于 ATAC-Me 測序深度，且一些 TF 可以結合核小體 DNA，這在本研究數據中無法捕獲。未來研究可以通過基于 ChIP 的方法直接探測 TF 結合，并結合 DNAme 定量，以更好地理解 TF 結合與 DNAme 狀態之間的時間關系。