《Molecular Neurobiology》：Lacosamide Is a Novel Drug That Improves AGTPBP1 Knockout-Mediated Impairment of Neuronal and Dopaminergic Function
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為探究 AGTPBP1 基因在神經元和多巴胺能神經元中的作用及相關疾病治療策略，研究人員構建 AGTPBP1 基因敲除（KO）細胞和斑馬魚模型開展研究。結果顯示，AGTPBP1 KO 會引發多種異常，而拉考沙胺（LCM）可改善這些狀況。這為相關神經疾病治療提供新方向。
在神經科學的神秘領域中，有一種罕見的疾病 —— 兒童期起病的小腦萎縮性神經退行性疾�。–ONDCA），如同隱藏在黑暗中的 “病魔”，無情地侵蝕著孩子們的健康。它是由 ATP/GTP 結合羧肽酶 1（AGTPBP1）基因變異引起的，患者會出現肌張力低下、發育遲緩、認知能力下降、共濟失調和肌肉無力等癥狀，小腦萎縮尤為明顯，部分患者還伴有肌張力障礙，這暗示著多巴胺能系統可能也受到了影響 。然而，AGTPBP1 基因究竟如何影響神經發育，特別是在多巴胺能神經元中的作用機制，一直是困擾科學家們的謎題。
為了揭開這一謎題，來自中國臺灣大學等研究機構的研究人員踏上了探索之旅。他們開展了一系列研究，旨在深入了解 AGTPBP1 基因的功能以及尋找潛在的治療方法。研究結果表明，AGTPBP1 基因敲除（KO）會導致神經元分化受損、線粒體功能障礙、氧化應激增加和多巴胺能亢進狀態。而拉考沙胺（LCM）這種藥物，就像一把神奇的 “鑰匙”，能夠改善由 AGTPBP1 基因敲除或敲低引起的異常表型，包括改善線粒體膜電位、減少活性氧（ROS）生成、使神經突生長正�；�、增加腦容量以及增強斑馬魚的運動功能。這一研究成果發表在《Molecular Neurobiology》雜志上，為相關神經疾病的治療帶來了新的希望和方向。
在研究過程中，研究人員運用了多種關鍵技術方法。首先，利用 CRISPR/Cas9 基因編輯技術構建 AGTPBP1 基因敲除的 IMR-32 神經母細胞瘤細胞系；通過顯微注射嗎啉代寡核苷酸（MO）在斑馬魚胚胎中敲低 AGTPBP1 基因表達。同時，運用蛋白質免疫印跡（Western blot）檢測蛋白表達水平，高效液相色譜 - 電化學檢測（HPLC-ECD）測定多巴胺代謝產物高香草酸（HVA）濃度，以及使用 Seahorse 分析儀檢測線粒體 ATP 生成等。
下面讓我們詳細了解一下研究結果。
- AGTPBP1 影響細胞增殖和神經元分化：研究人員通過 MTT 法檢測細胞增殖和分化能力，發現 AGTPBP1 基因敲除細胞在培養 7 天后，MTT 吸光度水平顯著降低，神經元分化時同樣如此，但 Hoechst 染色顯示細胞死亡無明顯差異，這表明 AGTPBP1 基因缺失會減少細胞增殖，但不影響細胞死亡。
- AGTPBP1 影響分化過程中的線粒體功能：研究人員推測 AGTPBP1 基因敲除會影響線粒體功能，于是檢測了分化第 7 天細胞的 ROS 生成和線粒體膜電位。結果發現，AGTPBP1 基因敲除細胞的 ROS 生成顯著增加，線粒體膜電位顯著降低，這表明 AGTPBP1 基因敲除會損害線粒體功能。
- AGTPBP1 缺失導致異常的神經突過度生長和 CRMP2 表達增加：通過相差顯微鏡測量神經突長度、免疫染色觀察神經突形成以及蛋白質免疫印跡檢測 CRMP2 表達，發現 AGTPBP1 基因敲除細胞的最長神經突長度顯著增加，CRMP2 蛋白水平在分化第 7 天也顯著升高，且其磷酸化形式減少。這說明 AGTPBP1 缺失會導致神經突過度生長，與 CRMP2 上調和磷酸化形式減少有關。
- LCM 通過 CRMP2 調節 AGTPBP1 基因敲除細胞的神經突生長：研究人員用 LCM 處理細胞，發現 LCM 能顯著縮短 AGTPBP1 基因敲除細胞的神經突長度，降低 CRMP2 蛋白水平，并增加其磷酸化水平，這表明 LCM 可改善 AGTPBP1 基因敲除神經元中異常的神經突過度生長。
- LCM 挽救 AGTPBP1 基因敲除細胞的細胞活力和線粒體功能障礙：通過谷氨酸誘導細胞毒性實驗、檢測 ROS 生成、線粒體膜電位和 ATP 合成，發現 LCM 在基礎條件下能部分恢復 AGTPBP1 基因敲除細胞的細胞活力，改善線粒體功能，但在谷氨酸處理條件下，其保護作用會減弱。
- AGTPBP1 在多巴胺能功能中起作用：研究人員通過蛋白質免疫印跡分析多巴胺能標記物和 HPLC-ECD 測量 HVA 濃度，發現 AGTPBP1 基因敲除細胞處于多巴胺能亢進狀態，而 LCM 處理可使其恢復正常。
- LCM 改善 AGTPBP1 敲低斑馬魚的腦大小：研究人員給斑馬魚胚胎注射 AGTPBP1 MO，發現其前腦、中腦和小腦體積顯著減小，而 LCM 處理可使其體積顯著增加，這表明 LCM 能改善因 AGTPBP1 功能喪失導致的斑馬魚腦體積減小。
- LCM 改善 AGTPBP1 敲低斑馬魚的運動障礙：研究人員通過記錄斑馬魚的運動軌跡和分析運動參數，發現 AGTPBP1 敲低的斑馬魚運動能力受損，而 LCM 處理可顯著改善其運動功能。
- AGTPBP1 MO 注射斑馬魚中 CRMP2 表達和腦 HVA 的變化：研究人員檢測斑馬魚腦內 HVA 水平和 CRMP2 表達，發現 AGTPBP1 MO 注射后 HVA 水平有輕微增加趨勢，添加 LCM 后有所降低但不顯著；CRMP2 表達也只有輕微增加且不顯著。
研究結論和討論部分指出，該研究首次證明了 LCM 對 AGTPBP1 基因敲除或敲低引起的異常表型具有改善作用，這為 AGTPBP1 相關神經退行性疾病的治療提供了新的潛在策略。雖然研究中還存在一些尚未明確的機制，如 LCM 對 AGTPBP1 基因敲除細胞多巴胺能功能影響的具體機制等，但這一研究成果無疑為后續研究奠定了重要基礎，有望在未來為相關疾病的治療帶來新的突破，為患者帶來更多的希望。
