膠質母細胞瘤(GBM)作為最具侵襲性的腦腫瘤，其IDH野生型亞型因顯著的細胞異質性和治療抵抗性導致臨床預后極差。傳統研究受限于樣本量和技術手段，對腫瘤內(intratumor)和腫瘤間(intertumor)異質性的認識存在盲區。單細胞RNA測序(scRNA-seq)雖已揭示部分細胞狀態，但酶解消化過程可能導致神經元等脆弱細胞類型的丟失，且缺乏對多層次異質性相互關系的系統解析。這些瓶頸嚴重制約了GBM精準治療策略的開發。

為突破這些限制，由美國麻省總醫院、以色列魏茨曼科學研究所等機構組成的國際團隊開展了大規模多中心研究。研究人員收集121例IDH野生型GBM樣本（含59例患者的原發-復發配對樣本），創新性地采用冷緩沖液均質化的單核RNA測序(snRNA-seq)技術，克服酶解法缺陷，同時整合全外顯子測序(WES)和全基因組測序(WGS)數據。通過建立GBM抗性與演化細胞分析(CARE)聯盟，構建了包含429,305個核的跨中心數據集，并開發新的計算分析方法解析多層次轉錄架構。

關鍵技術包括：1) 跨七家醫療中心的121例樣本隊列建立；2) 10x Genomics和Smart-seq2雙平臺單核轉錄組測序；3) 基于非負矩陣分解(NMF)的元程序(MP)識別算法；4) 拷貝數變異(CNA)推斷的惡性細胞分類流程；5) 空間轉錄組數據驗證。

【細胞狀態圖譜的擴展】
通過NMF分析鑒定出10個惡性細胞元程序(MP)，其中7個與既往研究一致（如MES-like、OPC-like），新增3種重要狀態：1) NEU-like狀態（表達NRG1/3等神經元分化標志）；2) GPC-like狀態（MEIS1/EGFR高表達的放射膠質樣前體）；3) Cilia-like狀態（特異性表達DNAH家族纖毛基因）。單核技術使NEU-like細胞檢出率較單細胞數據提高6倍，證實酶解法會丟失形態復雜細胞。Smart-seq2數據交叉驗證顯示，新狀態在原發瘤和不同醫療中心樣本中均穩定存在。

【混合狀態揭示轉化軌跡】
約20%細胞呈現"混合狀態"，表達兩種程序特征。高頻混合對（如AC-like/GPC-like）提示特定轉化路徑，構建的GBM狀態網絡模型顯示：GPC-like位于中心節點，連接NEU-like、AC-like和MES-like三向分化軌跡，暗示其可能作為多能祖細胞。這種架構與正常神經發育軌跡相似，支持"腫瘤劫持發育程序"假說。

【基線程序的發現】
創新性提出"細胞狀態控制"分析法，通過偽批量(pseudo-bulk)比較消除狀態組成差異，首次識別出三種跨狀態保守的基線表達程序(BP)：1) BP-NEU（神經相關）；2) BP-glial（膠質相關）；3) BP-ECM（細胞外基質）�？臻g轉錄組證實BP具有瘤內一致性，與TCGA分型部分重疊（BP-ECM與MES亞型相關P=0.02）。

【微環境互作網絡】
62個腫瘤微環境(TME)MP分析顯示：MES-like惡性細胞與促炎巨噬細胞(TAM)和血管內皮細胞共富集；NEU-like細胞與神經元存在NRXN-NLGN配受體互作；缺氧微環境同時塑造惡性細胞（hypoxia MP）和TAM的炎癥表型。CellChat分析揭示腫瘤核心區（IGF1-IGF1R信號）與周邊區（PTN-PTPRZ1介導的OPC互作）存在截然不同的細胞通訊模式。

【遺傳驅動因素】
CDK4擴增與NPC-like、PDGFRA擴增與OPC-like的已知關聯被證實。新發現：1) EGFR擴增/MDM2擴增/7號染色體增益/10p缺失/TERT啟動子突變共同驅動GPC-like狀態（突變組占比12% vs 野生組1%，P=0.003）；2) TP53突變與NEU-like狀態正相關；3) NF1突變持續關聯MES-like狀態和BP-ECM程序。

【三層生態系統模型】
整合分析提出GBM三種 stereotypic生態系統：1) "NEU生態"：TP53/RB1突變+神經元富集TME+BP-NEU；2) "ECM生態"：NF1突變+巨噬細胞浸潤+BP-ECM；3) "Glial生態"：EGFR/MDM2擴增+高惡性純度+BP-glial。52例(43%)樣本符合此模式（P<0.01），其余展現獨特組合，反映GBM復雜性。

這項研究通過多組學整合和計算方法創新，建立了IDH野生型GBM迄今最全面的轉錄架構模型。其科學價值體現在：1) 技術層面，證實單核測序在捕獲神經元等脆弱細胞上的優勢；2) 理論層面，首次闡明BP這一超越細胞狀態的腫瘤固有特征；3) 臨床層面，GPC-like狀態與EGFR等靶向治療靶點的關聯為精準分型提供新依據。伴隨研究（Spitzer et al.）將進一步揭示該架構在治療壓力下的演化規律。局限性在于部分罕見突變（如H3F3A）的樣本不足，未來需擴大隊列驗證。該成果為理解GBM異質性起源和開發生態位靶向策略奠定了里程碑式的基礎。