《Experimental Neurology》：Atlas of temporal molecular pathological alterations after traumatic brain injury based on RNA-Seq
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創傷性腦損傷（TBI）危害大且治療困難。研究人員通過 RNA-seq 和 WGCNA 等技術，分析 TBI 后小鼠腦組織分子病理變化。發現炎癥、神經元恢復、髓鞘再生等進程的變化規律，為 TBI 治療提供新方向。
創傷性腦損傷（Traumatic Brain Injury，TBI），這個隱匿在生活暗處的健康殺手，時刻威脅著人們的生命與生活質量。每年，全球有 5000 萬到 6000 萬例 TBI 發生，僅美國在 2014 年就有 253 萬人因 TBI 緊急就醫。TBI 不僅在急性期奪命，還會在后續漫長的日子里，讓患者飽受運動、情感障礙之苦，記憶力減退、注意力不集中等認知問題頻發，甚至大大增加患癡呆癥的風險，給家庭和醫療系統帶來沉重負擔。
當前，TBI 的治療面臨著重重困境。原發性損傷往往瞬間發生且難以逆轉，治療主要聚焦于減輕繼發性損傷、促進神經修復與再生。然而，TBI 后的病理生理過程極為復雜，炎癥反應、細胞死亡、血腦屏障破壞、白質變性等繼發性損傷機制與軸突再生、突觸重塑等內源性修復機制相互交織，且隨時間動態變化。但目前，對這些關鍵病理生理變化的時間進程，仍缺乏系統研究。為了打破這一困境，中國 - 日本友好醫院的研究人員踏上了探索之旅。他們開展了一項深入研究，旨在揭示 TBI 后分子病理變化的奧秘。研究成果發表在《Experimental Neurology》雜志上，為 TBI 的治療帶來了新的曙光。
研究人員主要運用了以下關鍵技術方法：首先，構建 TBI 小鼠模型，將 C57BL/6 雄性小鼠分為 11 組，包括假手術組和不同時間點的損傷組。接著，對小鼠腦組織進行 RNA 提取和測序，獲取基因表達數據。隨后，利用加權基因共表達網絡分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis，WGCNA）構建基因共表達網絡，識別關鍵模塊。還借助 STRING 數據庫和 Cytoscape 軟件篩選樞紐基因，并運用 Mfuzz 方法進行驗證。此外，通過單細胞 RNA 測序、定量實時聚合酶鏈反應（RT-qPCR）、蛋白質免疫印跡（Western blot，WB）、免疫熒光（Immunofluorescence，IF）等技術對相關基因進行驗證分析。
下面來看看具體的研究結果：
- WGCNA 分析確定關鍵模塊的時間模式：通過 RNA 測序對 11 個時間點的 33 個樣本分析，經 WGCNA 聚類得到 14 個基因模塊。其中藍色、綠黃色、綠色、藍綠色和黃色模塊表達隨時間呈現不同規律變化。如藍色模塊表達逐漸下降，藍綠色模塊先升后降，黃色模塊持續上升。
- 關鍵模塊的功能富集分析：對上述五個關鍵模塊進行功能富集分析，發現藍色模塊與突觸形成相關，綠黃色模塊參與炎癥和免疫調節，綠色模塊涉及白細胞遷移和免疫反應，藍綠色模塊與細胞增殖和免疫調節有關，黃色模塊主要參與神經膠質生成和髓鞘形成。Nissl 染色和免疫熒光結果也證實了相關結論，如 Nissl 染色顯示損傷早期尼氏體數量減少，3 - 7 天后逐漸增加；GFAP 免疫熒光染色表明 7 天后星形膠質細胞活化增強。此外，將綠黃色、綠色和藍綠色模塊定義為神經炎癥相關模塊（NIRMs），Iba1 染色顯示 3 - 7 天小膠質細胞大量浸潤，反映炎癥激活和繼發性損傷過程。
- Mfuzz 分析基因表達和功能動態變化：Mfuzz 分析將基因分為 10 個簇，其中 2、4、6、9、10 簇變化明顯。功能富集分析發現，6 簇與神經膠質生成等相關，4 和 10 簇與突觸功能和認知有關，2 和 9 簇參與免疫反應和細胞增殖調節。同時，差異表達分析和基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）表明，不同時間點細胞遷移、炎癥、白細胞增殖、神經元突觸可塑性、神經膠質生成等功能通路分別被激活或抑制。
- 確定關鍵模塊的樞紐基因：利用 STRING 數據庫和 Cytoscape 軟件確定各模塊樞紐基因。如藍色模塊的 Dlg4、Grin1 等與突觸功能有關；綠黃色模塊的 Jun、Fos 等參與炎癥反應；綠色模塊的 Icam1、Il1β 等在免疫細胞遷移和炎癥中起作用；藍綠色模塊的 Casp3、Tlr4 等與細胞凋亡和免疫反應相關；黃色模塊的 Mog、Plp1 等與神經膠質細胞再生和髓鞘形成有關。RT-qPCR 驗證結果與模塊時間表達模式相符。
- 單細胞測序數據集驗證：利用單細胞 RNA 測序數據驗證樞紐基因表達。將細胞分為 9 個譜系，發現不同細胞類型中樞紐基因表達存在差異。如 Dlg4、Grin1 在神經元中表達較高，Jun、Fos 等在小膠質細胞中表達為主，Mog、Plp1 在少突膠質細胞中高表達。且 7 天 TBI 組與假手術組相比，部分基因表達有差異，進一步證實 WGCNA 分析結果。
- TBI 后焦亡基因的表達：焦亡是一種炎性程序性細胞死亡過程，研究發現綠黃色、綠色和藍綠色模塊與焦亡相關基因集有交集。綠色和藍綠色模塊包含焦亡關鍵基因，綠黃色模塊含有炎癥因子。RT-qPCR 和 WB 分析表明，非經典焦亡途徑可能比經典途徑更早激活，Casp11 表達先于 Casp1。
在研究結論和討論部分，研究人員通過 RNA 測序結合 WGCNA 分析，揭示了 TBI 后小鼠大腦轉錄組的時間變化。發現炎癥在 6 - 3 天達到高峰，神經元恢復過程在 7 天尚未開始，而髓鞘再生和膠質形成在 7 天高度活躍。這一研究成果意義重大，WGCNA 分析為研究疾病進展過程中轉錄組變化的時間動態提供了有效方法，讓人們對 TBI 后的病理生理過程有了更深入的理解，為未來開發針對 TBI 不同階段的精準治療策略奠定了基礎，有望改善 TBI 患者的預后，減輕家庭和社會的負擔。
