大腦皮質掌控著從感覺運動到情感等復雜行為，其細胞類型多樣且呈分層結構。在神經發育過程中，神經管閉合后，Wingless/int-1（WNT）、骨形態發生蛋白（BMP）和音猬因子（SHH）等形態發生素確定大腦區域化和神經發生的初始軸線。小鼠胚胎 9 天（E9）時，神經上皮細胞分化為放射狀膠質細胞，標志著皮質神經發生開始。放射狀膠質細胞通過不對稱分裂產生新神經元，并為其遷移提供支架。在胚胎 17 天（E17）前，大腦皮層的大部分投射神經元由大腦半球的放射狀膠質細胞產生；而中間神經元則從胚胎 13 天（E13）開始由大腦半球下的區域產生，并遷移到大腦半球。胚胎 18 天（E18）后，放射狀膠質細胞開始產生或轉變為神經膠質細胞，如星形膠質細胞和少突膠質細胞。

經典遺傳學研究發現了多個對皮質發生至關重要的轉錄因子（TFs）。近年來，基于 CRISPR 的基因編輯、單細胞基因組學和體內靶向大腦的病毒策略等分子技術的發展，讓我們對 TFs 在皮質發生中細胞類型特異性作用、相互網絡關系以及在細胞類型形成和維持中的關鍵時間點有了更深入的了解。雖然空間組學工具在皮質發育研究中也很重要，但由于篇幅限制，本文不做討論。

細胞類型特異性 TFs 是細胞類型定型過程中的關鍵分子，很大程度上決定了細胞的形態、位置和功能。在整個皮質神經發生過程中，一些 TFs 在特定細胞類型中表達，如 Tbr1 在第 6 層投射神經元中、Fezf2 在第 5 層錐體束投射（PT）神經元和腦內投射（IT）神經元中、Dlx1/Dlx2 在大腦半球下的皮質中間神經元中。

通過敲除轉基因小鼠模型研究發現，TFs 對皮質神經發生的多個方面至關重要，如區域和分層命運決定。例如，Pax6 - Tbr2 - Tbr1 在大腦半球的表達模式對分層命運決定至關重要。Tbr1 敲除后，額葉皮質身份會轉變為尾側，且第 6 層投射神經元身份維持需要 Tbr1 。敲除 Tbr1 后，第 6 層投射神經元的相關基因特征改變，還獲得了第 5 層神經元的獨特電生理特性。

除 Tbr1 外，Fezf2、Foxg1 和 Satb2 等 TFs 也通過敲除小鼠研究被發現參與調節分層命運，且它們之間相互作用和調控。這些研究表明皮質分層命運可能由 TFs 網絡編程，同時也存在如終端選擇基因決定細胞命運的假說，Fezf2 可能就是定義皮質脊髓運動神經元的終端選擇基因。不過，仍需要高通量方法來全面描繪這一動態過程。

為實現高通量研究，從批量 RNA 測序轉向單細胞基因組分析是關鍵一步。批量 RNA 測序在特定條件下可分析特定細胞類型，但為每種細胞類型構建轉基因動物或探針既復雜又低效。單細胞基因組分析則可直接測量單個細胞的 RNA，以表征細胞類型的異質性。

過去幾十年，技術發展使單細胞分析取得巨大進步，從微陣列技術到下一代測序，檢測靈敏度提高；通過用獨特 DNA 序列標記細胞，通量也得以提升�；�于液滴或微孔的單細胞 RNA 測序（scRNA - seq）技術使分析的細胞數量從幾百個增加到數萬個。雖然批量 RNA 測序更具成本效益，但 scRNA - seq 在解析細胞類型特異性表達、揭示細胞類型異質性以及進行細胞軌跡和譜系分析等方面具有明顯優勢。

多個研究小組應用 scRNA - seq 對發育中的小鼠皮質細胞類型及其基因表達模式進行分類，構建了發育中小鼠體感皮質、大腦皮質和整個胚胎腦的單細胞轉錄圖譜，這些數據集高分辨率展示了皮質發生過程中的細胞組成和 TF 調控網絡動態變化。

研究發現，在全腦水平上，神經發生向神經膠質發生的轉變發生在 E12 - E16 ；新皮質頂端祖細胞在 E13 開始分化為神經元和神經膠質分支，且神經元分支祖細胞富含神經發生標記物，神經膠質分支則富含放射狀膠質細胞標記物和增殖相關基因。在神經元分支中，祖細胞群體形成按年齡排序的分化連續體，而非離散亞型。同時，已知的胼胝體神經元和皮質傳出神經元標記物雖在祖細胞中廣泛表達，但并不決定細胞類型聚類。這些表明皮質祖細胞可在逐漸改變分子特征的同時，沿連續體維持其潛能。

這一模型得到其他研究的證實。此外，一些研究通過 DNA 條形碼追蹤細胞譜系，發現早期標記的祖細胞產生的克隆分化為不同細胞類型的比例更高，且隨著時間推移祖細胞的潛能降低。還有研究通過特定策略標記不同時間的祖細胞，分析其轉錄組變化，發現早期和晚期標記的祖細胞表達不同的基因程序。

RNA 分析還可與染色質可及性、DNA 甲基化和三維基因組結構等數據整合，構建皮質發育的整體調控景觀。通過單細胞轉座酶可及染色質測序（scATAC - seq）等技術，研究人員發現祖細胞在分化過程中保留共同分子身份，同時也明確了 TFs 在細胞命運決定過程中對染色質景觀重組的關鍵作用，如 Neurog2 在調節增強子活性、DNA 甲基化和染色質可及性方面的新作用。

然而，目前系統研究分子作用對大腦發育因果影響的能力仍有限，傳統構建單個基因敲除模型的方法難以擴展，這促使了功能基因組技術的發展。

CRISPR - Cas9 基因編輯技術的發展使得體內快速高效構建基因敲除模型成為可能�；�于此，多個團隊開發了 Perturb - seq 或 CROP - seq 等技術，將多重基因編輯與單細胞轉錄組表型分析相結合，實現高通量、高內涵的遺傳篩選。

Jin 團隊開發的體內 Perturb - seq 技術，可在體內單細胞水平對多個基因進行研究和基因型 - 表型映射，將體內功能遺傳學的表型測量單位從動物縮小到細胞。他們應用該技術研究了 35 個與自閉癥譜系障礙相關的新生風險基因，相比傳統逐個構建轉基因動物模型，大大節省了時間和成本。通過結合可擴展的基因擾動和高分辨率 scRNA - seq 讀數，明確了受風險基因影響的細胞類型和基因程序，有助于分層分析基因型 - 表型異質性。

這一方法還被用于研究 Meis2 對側腦室隆起（LGE）來源的 GABA 能投射神經元（PNs）譜系選擇和激活的作用。研究人員設計了一種基于轉座酶的整合盒，可表達 gRNAs 和克隆 DNA 條形碼，通過電穿孔將質粒導入胚胎，對擾動細胞進行 scRNA - seq 分析，確定了受 Meis2 敲除影響最大的 PN 簇，并通過克隆追蹤分析證實了 Meis2 擾動導致有絲分裂后產生的細胞從 PN 向中間神經元（IN）轉變，驗證了體內 Pooled CRISPR 篩選策略的可行性和有效性。

將 Perturb - seq 應用于體內研究面臨著從完整組織中標記細胞有限的挑戰。與慢病毒相比，腺相關病毒（AAV）具有更高的組織穿透性和標記效率。兩項最新研究分別采用 AAV 進行 Perturb - seq 實驗。

Santinha 團隊使用靜脈注射的 AAV9 - PHP.B 血清型，分析了 22q11.2 缺失綜合征相關的 29 個基因在注射 4 周后對 6 種皮質細胞類型的擾動效應。Zheng 團隊鑒定出一種針對新生神經元的快速作用血清型 AAV - SCH9，并利用 piggyBac 轉座子在胚胎腦中引入可遺傳和持續的 gRNA 表達，提高基因編輯效率。他們通過測試不同 AAV 劑量優化轉導率，將針對 Foxg1 和 Tbr1 等四個 TFs 的 gRNA 文庫導入胚胎 14 天（E14）的側腦室，對多種細胞類型進行標記和擾動。

對出生后 7 天（P7）的大腦進行轉錄組分析發現，Tbr1 擾動對第 5 層和第 6 層投射神經元影響顯著，導致第 6 層 - CT 投射神經元中 Fezf2（第 5 層標記）上調，Neurod1 和 Neurod2（第 6 層標記）下調。Foxg1 擾動則引起細胞類型特異性的分層特征變化，在第 6 層 CT 神經元中出現混合細胞亞群，且通過差異基因表達分析發現其影響了黏附和突觸分子的調節，還導致一些 TFs 異位表達。這些結果表明基于 AAV 的體內 Perturb - seq 能夠檢測不同細胞類型的全基因組分子表型，解析 TFs 在皮質發生中的功能。

Perturb - seq 不僅可用于研究小鼠皮質神經發生，還可探索人類皮質神經發生的潛在機制。人類大腦皮質發生持續約 4 個月，雖神經元數量遠多于小鼠，但具有相似的多層結構。體外三維腦類器官可由人類多能干細胞誘導形成，能模擬人類產前大腦的分層神經元組織和轉錄組、表觀基因組特征。

Fleck 團隊構建了人類腦類器官發育的多組學圖譜，擾動 20 個 TFs 后發現 GLI3 對背腹神經元命運特化至關重要。Esk 團隊通過 CRISPR 篩選擾動 172 個與小頭畸形相關的風險基因，發現 32 個基因的 gRNAs 顯著減少，表明這些基因促進細胞增殖。Li 團隊對 36 個自閉癥譜系障礙風險基因進行人類腦類器官篩選，確定了產前發育中對這些風險基因特別敏感的細胞類型，并分析了差異表達基因的共享下游效應。

隨著體內遺傳篩選技術的不斷改進和拓展，其應用前景將更加廣闊。目前，體內篩選的通量受細胞標記和從活組織中獲取細胞效率的限制，用 AAV 替代傳統慢病毒載體已取得一定進展，未來病毒工程有望進一步提高檢測通量，實現跨組織類型的體內全基因組篩選。

當前體內 Perturb - seq 主要依賴 scRNA - seq 作為讀數，組織解離會導致非細胞自主表型丟失。未來技術發展應整合更多讀數，如空間轉錄組學，同時結合基因組學、表觀基因組學（染色質可及性、DNA 甲基組、三維基因組結構等）和細胞水平（形態學、電生理學等）的多組學讀數，全面研究基因型 - 表型關系。

優化體內擾動效應也非常重要，使用多個 gRNAs 可提高編輯效率。此外，還可在病毒嗜性、轉基因表達起始時間和基因編輯起始時間等方面進行優化，精準控制遺傳擾動的時間和位置。除了 CRISPR 基因敲除篩選，整合 CRISPR 激活（CRISPRa）、CRISPR 干擾（CRISPRi）和引導編輯等其他遺傳干預方式，能夠在基因的不同功能狀態下進行表型分析。同時，表觀遺傳操作方法可用于研究非編碼調控元件，構建編碼和非編碼基因組調控機制的綜合景觀。通過多重擾動同時靶向多個基因，Perturb - seq 有望在剖析神經發育中的基因調控網絡方面發揮更大作用。

解析多種腦細胞的生成、成熟過程及其遺傳易感性，是理解大腦復雜性和腦部疾病易感性的關鍵。單細胞多模態分析和體內 Perturb - seq 等技術的發展，為實現這一目標提供了有力支持。隨著實驗可分析細胞數量增加、成本降低以及擾動靶向能力的提升，相關研究將加速推進。新興的基因組和成像工具將為研究增添新維度，Perturb - seq 和功能基因組學產生的新假設可通過更多模型和實驗進一步驗證。未來，整合細胞形態學、電生理學、鈣成像和神經元連接分析等多種方法，將為全面理解大腦分子機制帶來前所未有的機遇，尤其在應用于更多腦區和跨物種研究時，有望拓展我們對大腦發育遺傳機制的認識。