《Current Biology》：Expression of clock genes tracks daily and tidal time in brains of intertidal crustaceans Eurydice pulchra and Parhyale hawaiensis
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本文通過對潮間帶甲殼動物（Eurydice pulchra 和 Parhyale hawaiensis）大腦中生物鐘基因表達的研究，發現了約 60 個推定的時鐘細胞，其基因表達可追蹤日潮時間，這為揭示潮汐生物鐘機制及相關神經網絡提供了關鍵線索，極具研究價值。
研究背景
生物體通過內部生物鐘驅動的代謝、生理和行為節律來適應周期性環境。陸地環境周期以日為主，生物進化出約 24 小時周期的生物鐘（circadian clock）；沿海環境更復雜，海洋生物還進化出潮汐（約 12.4 小時）、半月（約 14.8 天）和月運（約 29.5 天）等計時機制。然而，潮汐生物鐘的機制尚不清楚，目前有三種主要假說：一是潮汐和晝夜節律由單一可塑性振蕩系統驅動；二是由成對的內在周期約 24.8 小時的生物鐘反相運行產生潮汐節律；三是存在獨立的 12.4 小時和 24 小時振蕩器分別驅動潮汐和晝夜表型。
動物的晝夜生物鐘圍繞轉錄 / 翻譯反饋環（TTFL）運行，正調控因子 CLOCK（CLK）和 BMAL1（或果蠅中的 CYC）通過 E-box 啟動子位點激活編碼負調控因子 PERIOD（PER）、CRYPTOCHROME2（CRY2）和 / 或 TIMELESS（TIM）的基因，負調控因子積累后抑制激活，降解后循環重啟。潮間帶的 Eurydice pulchra 和 Parhyale hawaiensis 能表現出自發的晝夜和 / 或潮汐運動行為節律，但目前僅知道 E. pulchra 的潮汐計時分子標記與線粒體基因表達和細胞氧化還原狀態有關。這兩種動物都含有編碼 CLK、BMAL1、PER 和 CRY2 的基因，且 Bmal1 基因的缺失會影響它們的潮汐活動節律，暗示晝夜和潮汐生物鐘在分子遺傳水平可能存在相互作用。本研究旨在描述 Bmal1、Clk、per 和 cry2 等基因在大腦中的表達，識別推定的 “時鐘” 細胞，并探究它們與晝夜和潮汐行為的關系。
研究方法
- 實驗動物采集與飼養：E. pulchra 于英國安格爾西島 Llanddona 海灘春季漲潮時用手拖網采集成年個體；P. hawaiensis 的 Chicago F 品系在實驗室中用特定條件飼養，包括適宜的溫度、光照周期、海水鹽度、食物供應和定期換水等。
- 行為分析：通過特定的活動監測設備和軟件記錄 E. pulchra 和 P. hawaiensis 的游泳或運動行為。對 E. pulchra，在黑暗條件下記錄其游泳行為，分析其潮汐游泳活動的節律性；對 P. hawaiensis，監測其在不同條件下的運動活動，通過不同的統計方法判斷其是否具有節律性以及節律的周期和強度。
- 大腦樣本處理：實驗動物經麻醉后，在冰浴的生理鹽水中解剖大腦，隨后固定、脫水并儲存。用于免疫組織化學（immunohistochemistry）和原位雜交實驗時，需先將大腦樣本復水、洗滌和平衡。
- 免疫組織化學：用抗 SYNORF1 抗體標記神經氈，不同動物的處理步驟略有差異。E. pulchra 需進行通透處理，與抗體孵育后再與二抗孵育，最后用 DAPI 染色；P. hawaiensis 則是先與抗體在特定緩沖液中孵育，洗滌后與二抗孵育，再用 DAPI 染色，最后進行樣品制片。
- 參考大腦構建：對免疫標記的大腦樣本進行成像，通過特定軟件對多個大腦圖像進行配準和平均，構建 E. pulchra 和 P. hawaiensis 的參考大腦，用于后續分析。
- 雜交鏈式反應熒光原位雜交（HCR-FISH）：設計并合成針對特定基因的 HCR 探針，按照優化后的實驗步驟進行操作，包括樣本通透、預雜交、探針雜交、信號放大、DAPI 染色和樣本制片等，用于檢測基因表達。
- RNAscope 方法：對 E. pulchra 的大腦進行特定處理，制作石蠟切片，按照 RNAscope 試劑盒的說明進行操作，包括脫蠟、抗原修復、蛋白酶處理、雜交、信號放大和染色等步驟，用于檢測基因表達。
- 時間進程采樣設計：根據不同的研究目的，對 E. pulchra 和 P. hawaiensis 在特定條件下進行飼養和觀察，選取具有特定行為節律的個體，在不同時間點采集大腦樣本進行后續實驗。
- 全腦數字 HCR-FISH 及數據分析：對處理后的大腦樣本進行成像，通過特定軟件和算法對圖像進行處理和分析，包括細胞分割、斑點檢測和統計分析等，以量化基因表達水平和判斷其節律性。
研究結果
- 大腦中生物鐘基因的表達：在 E. pulchra 和 P. hawaiensis 的大腦中，Bmal1 表達廣泛且在光暗（LD）周期中強度不變；Clk 在 E. pulchra 大腦中表達廣泛，部分細胞信號較強，在 P. hawaiensis 大腦中則在中腦區域細胞有富集。per、cry2 和 tim 在 E. pulchra 大腦的中腦離散細胞簇中有強烈特異性信號，P. hawaiensis 大腦中 per 和 cry2 的表達模式與之相似。
- 推定時鐘細胞的確定：在 E. pulchra 大腦中，Clk 富集的細胞表達 Bmal1、per、cry2 和 tim，這些細胞共表達了功能性 TTFL 所需的基因，被認為是推定的時鐘細胞。P. hawaiensis 大腦中，Clk 富集的細胞也表達 Bmal1 和高濃度的 cry2，且 cry2 富集的細胞也表達 per，同樣被認定為推定的時鐘細胞。通過將 HCR-FISH 與抗 SYNORF1 免疫熒光結合，確定了這些細胞在大腦中的分布，E. pulchra 有 8 個細胞群，P. hawaiensis 有 9 個細胞群，每側半球約有 30 個細胞，分布對稱。
- E. pulchra 大腦中時鐘基因的節律性表達：野外采集的 E. pulchra 在實驗室自由運行條件下表現出強烈的潮汐活動節律。對其大腦進行 HCR-FISH 實驗發現，在 LD（16L:8D）條件下，per、cry2 和 tim 的總腦表達顯示出強烈的每日節律，峰值出現在黑暗后期；tim 的總表達還顯示出 12 小時的節律。在個體細胞群水平，5 個細胞群中一個或多個轉錄本有顯著節律，如中后細胞的 per 和 cry2 表達呈每日模式，峰值在深夜；內側細胞的 per 呈每日節律，tim 呈 12 小時節律；后外側細胞的 tim 有 12 小時周期。這表明不同細胞群在 E. pulchra 中似乎能夠追蹤每日或潮汐時間。
- P. hawaiensis 大腦中時鐘基因的晝夜和潮汐表達：實驗室飼養的 P. hawaiensis 經潮汐模擬訓練后，在自由運行條件下表現出潮汐活動節律，且其潮汐生物鐘對機械刺激敏感。對這些動物大腦進行 HCR-FISH 實驗發現，在潮汐訓練且表現出潮汐活動的動物中，per 的總表達呈晝夜節律，cry2 總表達無時間變化。在個體細胞群中，中后細胞和前內側 a1 細胞的 per 和 cry2 表達呈晝夜節律，且二者反相；背外側細胞的 per 和 cry2 表達呈 12 小時周期，且二者幾乎同相，峰值出現在主觀高潮后。多次實驗表明，這些細胞的表達模式具有穩定性，且背外側細胞能獨立于晝夜時間追蹤潮汐時間。
- P. hawaiensis 在 LD 周期下時鐘基因表達的變化：當 P. hawaiensis 在 LD 周期下無潮汐刺激時，表現出夜間活動的節律性。對其大腦的 HCR-FISH 分析顯示，per 和 cry2 的總表達呈節律性，多個細胞群包括中后細胞和前內側 a1 細胞的 per 和 cry2 表達呈每日模式且反相，但背外側細胞的 per 和 cry2 表達無統計學顯著節律。這表明背外側細胞的潮汐基因表達是特定于潮汐條件的，在無潮汐刺激時不表現出潮汐模式，也不跟隨其他細胞的每日節律。
研究討論
研究在 E. pulchra 和 P. hawaiensis 大腦中鑒定出約 60 個共表達多種時鐘基因的細胞，這些細胞分布在不同的離散細胞群中。Bmal1 雖對維持潮汐行為至關重要，但其在大腦中的廣泛表達未顯示出特定的細胞富集，而 Clk、per 和 cry2（以及 E. pulchra 中的 tim）在特定細胞群中的富集表明它們可能作為晝夜振蕩器發揮作用。
在 E. pulchra 中，不同細胞群的時鐘基因表達模式不同。在潮汐活動的個體中，per 和 cry2 的總表達呈每日節律，反映了它們的晝夜作用；tim 的總表達不僅有 24 小時的晝夜模式，還有 12 小時的節律，這在特定細胞群如內側和后外側細胞中體現為 12 小時的積累，表明這些細胞可能參與潮汐計時。在 P. hawaiensis 中，per 的表達在不同條件下表現出晝夜或潮汐節律，不同細胞群的 per 和 cry2 表達相位關系不同，提示不同物種的晝夜 TTFL 分子結構可能存在差異。背外側細胞在潮汐訓練后表現出穩定的潮汐基因表達模式，是專門的潮汐振蕩器的有力候選者，但目前還不清楚其獨特的分子機制，以及不同細胞群的時鐘基因表達與潮汐行為之間的確切關系。
此外，研究發現盡管大多數細胞表現出約 24 小時的振蕩，只有少數細胞表現出約 12 小時的振蕩，但動物整體卻表現出強烈的潮汐行為。這可能是因為潮汐刺激的多樣性和復雜性，導致部分潮汐細胞群在現有實驗條件下未被檢測到，或者不同潮汐細胞群對不同的潮汐刺激有反應。未來研究可通過改變潮汐刺激方式，如潮汐浸泡 / 暴露實驗，進一步探究潮汐細胞的功能和機制。
綜合研究結果，該研究數據支持存在專門的潮汐和晝夜定時器的模型，即不同細胞群中的經典晝夜基因可調節為潮汐或晝夜周期。這一發現為研究潮汐和晝夜生物鐘的輸入和輸出通路提供了細胞層面的基礎，有助于進一步明確晝夜和潮汐神經時鐘的本質和連接性，為深入理解生物的時間調控機制提供了重要線索 。
