《Nature》：Light-microscopy-based connectomic reconstruction of mammalian brain tissue
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為解決光鏡難以進行密集、突觸水平的電路重建問題，研究人員開展基于光鏡的連接組學（LICONN）研究。結果顯示，LICONN 可實現神經元結構追蹤、分子測量等。這為神經科學研究提供了新方法，助力深入理解大腦功能。
大腦，這個人體中最為神秘復雜的器官，猶如一座精密的超級計算機，神經元之間的連接如同錯綜復雜的電路，承載著人類的思維、情感和行為等諸多奧秘。在探索大腦奧秘的征程中，連接組學的發展至關重要。它旨在繪制神經元之間的連接圖譜，揭示大腦信息處理的機制。然而，目前的研究手段存在諸多挑戰。電子顯微鏡（EM）雖能以納米級分辨率進行密集的連接組分析，但在獲取分子信息方面存在局限，無法直接可視化特定分子，且樣本制備和讀出過程復雜，難以與分子信息直接關聯。光鏡（LM）雖具有獨特的可視化特定分子的能力，但傳統光鏡分辨率有限，難以區分密集標記的細胞結構，無法實現突觸水平的電路重建。在這樣的背景下，開展一項能夠突破現有技術局限的研究迫在眉睫。
奧地利的研究人員肩負起這一使命，開展了基于光鏡的連接組學（LICONN）技術研究。他們通過整合專門設計的水凝膠嵌入和擴張技術，以及基于深度學習的全面分割和連接性分析，成功實現了將分子信息直接融入腦組織的突觸水平重建。這一研究成果意義非凡，發表在《Nature》雜志上。它為研究大腦功能提供了一種強大的工具，有助于深入理解神經元之間的連接模式和信息傳遞機制，對神經科學領域的發展具有深遠影響。
研究人員采用了以下幾個主要關鍵技術方法：一是水凝膠嵌入和擴張技術，通過優化灌注、化學固定和水凝膠組成等步驟，實現組織的高保真擴張，提高分辨率；二是深度學習算法，運用洪水填充網絡（FFN）進行神經元結構的自動分割和突觸位置的預測；三是免疫標記技術，用于可視化特定蛋白質，識別不同類型的突觸和細胞結構。
下面來詳細了解一下研究結果：
- 腦組織的擴張用于連接組學研究：研究人員開發了一種迭代擴張技術，通過優化水凝膠的組成和處理步驟，實現了約 16 倍的組織擴張，且機械性能穩定。經該技術處理的腦組織，在亞細胞結構的成像上表現出色，能清晰呈現線粒體、高爾基體和初級纖毛等結構，同時在突觸處觀察到與電子顯微鏡數據相似的蛋白質密集特征，這表明該擴張和成像過程能從組織尺度到納米尺度高保真地反映腦組織的細胞成分。
- LICONN 中神經元結構的追蹤：研究人員通過與稀疏熒光標記對比，驗證了手動追蹤的可靠性。在對軸突和樹突的追蹤實驗中，結果顯示 LICONN 數據具有高可追溯性，排除了大量不可追蹤的 “孤兒” 棘突的存在。此外，手動重建神經元結構的實驗表明，LICONN 適用于詳細的體積注釋，盡管手動重建存在擴展性差的問題，但這也為后續自動化分析提供了基礎。
- 利用洪水填充網絡進行自動分割：研究人員訓練 FFN 對更大體積的腦組織進行分析，通過優化分割算法和手動校對，實現了與當前最先進的電子顯微鏡結果相媲美的自動分割精度。這一成果使得在納米尺度上詳細揭示神經元結構的復雜三維排列成為可能，為深入研究神經元之間的連接提供了有力支持。
- 分子注釋的連接組學：利用光鏡可視化特定分子的能力，研究人員通過免疫標記在結構背景下可視化突觸蛋白，精確測量了突觸蛋白之間的距離，并將突觸分子機制定位到相應的神經元結構上。這一發現為理解突觸的功能和分子組成提供了直接證據，有助于深入探究神經元之間的信號傳遞過程。
- 分子推斷的突觸連接性：研究人員基于免疫標記開發了一種自動突觸識別管道，通過該管道能夠準確識別興奮性和抑制性突觸，并將分子定義的突觸連接性映射到自動形態重建上。這一成果為研究神經元之間的連接模式和信息傳遞方向提供了重要依據，有助于構建更加準確的大腦連接組模型。
- 興奮性和抑制性突觸的識別：通過對抑制性突觸標記蛋白 gephyrin 的免疫標記，研究人員能夠清晰地區分興奮性和抑制性突觸。這一發現對于理解大腦中興奮和抑制的平衡機制至關重要，為進一步研究神經系統疾病的發病機制提供了新的視角。
- 連接性分析：研究人員通過對特定腦區的成像和分析，詳細研究了突觸連接的基本參數，包括抑制和興奮的比例。結果顯示，興奮性輸入主要集中在棘突頭部，而抑制性輸入在軸突和樹突的不同部位具有不同的分布特點。這一成果為理解大腦的信息處理和神經回路的功能提供了關鍵數據。
- 基于深度學習的突觸位置預測：為克服顯微鏡硬件和成像時間的限制，研究人員利用深度學習從結構數據中預測突觸分子的位置。實驗結果表明，該預測方法具有較高的準確性，能夠在無免疫標記的數據集上成功映射突觸輸入場，為大規模連接組學研究提供了一種高效的方法。
- 細胞類型和亞細胞結構的識別：結合結構和分子信息，研究人員不僅能夠準確分類細胞類型，還能通過分子標記明確亞細胞結構的身份，如 AIS 和髓鞘化軸突等。此外，對初級纖毛的研究發現，Hnrnpu 基因突變對海馬神經元初級纖毛長度無明顯影響，這一結果對于理解神經發育疾病的機制具有重要意義。
- 間隙連接的分子識別：研究人員通過免疫標記 connexin - 43，成功可視化了星形膠質細胞之間的電連接和細胞伙伴，同時結合其他標記實現了在同一電路中同時映射興奮性、抑制性和電連接性。這一成果為研究大腦中的電信號傳遞和神經膠質細胞的功能提供了新的方法和視角。
- 成像體積的無損軸向擴展：為擴大成像范圍，研究人員實施了塊面成像方法，通過對擴展水凝膠的切片和成像，實現了成像體積的軸向擴展，使神經元結構能夠在不同成像層之間連續追蹤。這一技術突破為全面分析細胞連接性提供了可能，有助于構建更完整的大腦連接組圖譜。
在結論和討論部分，LICONN 技術展現出顯著的優勢。與傳統的電子顯微鏡技術相比，它不僅能夠實現可靠的神經元結構追蹤和自動重建，還能直接測量空間分辨的分子信息，包括特定蛋白質、電突觸和關鍵亞細胞特征等。雖然目前獲取的組織體積相對有限，但通過水凝膠切片和軸向擴展等技術手段，有望實現更大體積的成像。此外，LICONN 技術還可通過整合空間轉錄組學方法，進一步擴展其分子信息內容，為多模態描述哺乳動物腦細胞提供可能，包括形態、連接性、生理學和基因表達等方面。該技術在研究神經發育疾病的基因型 - 表型關系和細胞改變方面也具有重要應用價值，并且有望在其他需要高分辨率組織分析的器官和系統研究中發揮作用�？傊�，LICONN 技術為連接組學研究提供了一種高度可及且強大的工具，為神經科學領域的發展開辟了新的道路，具有廣闊的應用前景。
