《Current Research in Toxicology》：RhoA/ROCK2 signaling pathway regulates Mn-induced alterations in tight junction proteins leading to cognitive dysfunction in mice
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為探究錳（Mn）暴露與血腦屏障（BBB）緊密連接蛋白（TJPs）的關系及潛在神經保護策略，研究人員構建小鼠和細胞模型開展研究。結果發現，Mn 暴露破壞 BBB 完整性、損害認知功能，天麻素（GAS）可緩解相關損傷，或通過調節 RhoA/ROCK2 通路。該研究為 Mn 神經毒性防治提供新方向。
在生命的舞臺上，微量元素錳（Mn）扮演著重要卻又復雜的角色。它是人體必需的微量元素，在許多生理過程中發揮著關鍵作用，比如參與多種酶的激活，對維持正常的新陳代謝意義重大。然而，就像 “水能載舟，亦能覆舟”，過量的錳暴露卻會引發一系列問題。過往研究表明，過量的錳會對神經系統發起攻擊，導致運動功能障礙、認知缺陷等多種神經疾病。這背后的原因與血腦屏障（BBB）密切相關，血腦屏障就像大腦的忠誠衛士，守護著中樞神經系統（CNS）的內環境穩定，防止有害物質入侵。一旦血腦屏障的完整性遭到破壞，各種有害物質就可能長驅直入，損害神經細胞，引發神經疾病。但目前，錳暴露破壞血腦屏障的具體分子機制，以及如何減輕錳對認知功能的損害，仍是未解之謎。
為了揭開這些謎團，國內研究人員開啟了探索之旅。他們精心設計并開展了一系列研究，試圖找出錳暴露與血腦屏障緊密連接蛋白（TJPs）之間的潛在聯系，同時探尋能夠減輕錳誘導認知損傷的有效策略。經過不懈努力，研究取得了重要成果。研究發現，錳暴露會顯著降低緊密連接蛋白的表達，破壞血腦屏障的完整性，進而損害小鼠的認知功能。而天麻素（GAS），這種從傳統中藥天麻中提取的生物活性化合物，卻有著神奇的效果。它不僅能夠有效減輕錳誘導的血腦屏障破壞，還能增強緊密連接蛋白的表達，改善小鼠的認知功能。進一步研究揭示，天麻素發揮這些作用，很可能是通過調節 RhoA/ROCK2 信號通路來實現的。該研究成果發表在《Current Research in Toxicology》雜志上，為深入理解錳介導的神經毒性機制提供了新視角，也為開發防治錳暴露相關認知功能障礙的新療法奠定了基礎 。
在研究過程中，研究人員運用了多種關鍵技術方法。在動物實驗方面，選用特定品系的小鼠構建錳暴露模型，通過腹腔注射等方式給予不同處理，之后采集血液和組織樣本。在行為學測試中，利用小鼠恐懼條件反射系統和新物體識別測試評估小鼠認知能力。在細胞實驗方面，培養 bEnd.3 細胞（永生化小鼠腦內皮細胞）模擬血腦屏障，運用 MTT 法檢測細胞活力，通過 RNA 提取和 RT-qPCR、免疫染色、Western blot 等技術分析基因和蛋白表達情況，還用 Transwell 實驗測定細胞單層通透性 。
下面詳細看看研究結果：
- Mn 暴露損害小鼠認知功能并破壞血腦屏障完整性：研究人員建立了亞急性錳暴露小鼠模型，結果顯示，與對照組相比，錳暴露組小鼠血液中錳含量大幅增加，大腦皮層和海馬區的錳含量也顯著上升。行為學測試中，新物體識別測試里小鼠辨別新物體的能力明顯下降；恐懼條件反射測試中，在條件刺激下，錳暴露組小鼠的凍結時間百分比顯著降低，這表明錳暴露損害了小鼠的認知功能。同時，通過尾靜脈注射熒光素鈉評估血腦屏障完整性發現，錳處理小鼠的大腦皮層和海馬區熒光強度顯著增加，且皮層血管的徑向長度縮短，說明錳暴露導致了血管損傷，破壞了血腦屏障的完整性。
- Mn 暴露降低緊密連接蛋白表達：研究人員用 bEnd.3 細胞進行體外實驗，發現 100 μM MnCl?處理 24 h 對細胞活力無顯著影響，便選用該濃度進行后續實驗。實驗結果顯示，錳暴露使細胞對大分子量 FITC - 葡聚糖的通透性增加，表明細胞膜通透性上升。進一步檢測發現，錳處理的 bEnd.3 細胞中，ZO - 1 和 Occludin（Ocln）的 mRNA 和蛋白表達均顯著下調；在錳暴露小鼠的腦組織結構中，同樣觀察到 ZO - 1 和 Ocln 的表達降低。這說明錳暴露在體內外均會導致緊密連接蛋白表達下調。
- 過表達 Ocln 改善錳暴露小鼠的認知能力并增加緊密連接蛋白表達：研究人員通過腺相關病毒（AAV）載體過表達 Ocln，結果發現，與對照組相比，過表達 Ocln 的錳暴露小鼠，大腦皮層的錳濃度顯著降低，認知功能得到改善，表現為新物體識別測試中的辨別指數升高。同時，皮層血管的徑向長度增加，且 Ocln 的 mRNA 和蛋白表達顯著升高，表明過表達 Ocln 可減輕錳誘導的認知損傷，增強緊密連接蛋白 Ocln 的表達。
- 天麻素保護血腦屏障并緩解錳暴露小鼠的認知功能障礙：給錳暴露小鼠使用天麻素后，小鼠血液和大腦中的錳含量顯著降低。行為學測試中，天麻素處理組小鼠在恐懼條件反射測試中的凍結時間百分比增加，認知功能得到改善；同時，血腦屏障的通透性降低，大腦皮層和海馬區的熒光強度減弱，說明天麻素對錳誘導的認知損傷有保護作用，可能是通過保護血腦屏障完整性和減少大腦中的錳積累來實現的。
- 天麻素通過上調 TJPs 表達保護血腦屏障免受錳損傷：在體內實驗中，給小鼠灌胃天麻素顯著逆轉了錳誘導的 ZO - 1 和 Ocln mRNA 表達下降，蛋白水平也有所增加。體外實驗中，20 μM 天麻素能有效緩解錳誘導的 bEnd.3 細胞中 ZO - 1 和 Ocln mRNA 和蛋白表達的降低，還降低了細胞對大分子量 FITC - 葡聚糖的通透性。這表明天麻素通過上調緊密連接蛋白的表達，維持了血腦屏障的完整性。
- 天麻素抑制錳處理的 bEnd.3 細胞中的 RhoA/ROCK2 通路：研究發現，錳處理會顯著上調 bEnd.3 細胞中 RhoA 和 ROCK2 蛋白的表達，而天麻素處理可減弱這種變化。使用 RhoA/ROCK 信號通路抑制劑 HA - 1077 后，ZO - 1 和 Ocln 蛋白表達上調。這說明天麻素可能通過抑制 RhoA/ROCK2 通路減輕錳的毒性。
綜合研究結論和討論部分，該研究首次揭示了錳會導致血腦屏障損傷和緊密連接蛋白表達下降，天麻素作為一種潛在的神經保護劑，可減輕錳誘導的血腦屏障損傷，緩解認知功能障礙，其作用機制可能與調節 RhoA/ROCK2 信號通路有關。這一研究成果為錳暴露相關神經毒性的防治提供了新的理論依據和潛在的治療靶點，對開發治療認知功能障礙相關疾病的新方法具有重要意義 。未來研究可進一步深入探究天麻素的治療方式，以及血腦屏障通透性改變在神經退行性疾病中的作用機制，為攻克這類疾病帶來新的希望 。
