神經系統功能依賴神經元間的突觸（有線連接）和 “無線” 的突觸外信號傳遞兩種主要通信模式。目前，突觸連接組的結構已通過連接組學領域的大量工作得以全面繪制，但像單胺和神經肽這類可擴散信號分子構成的無線信號網絡的組織方式，一直是研究難題，尤其是神經肽。

神經肽是神經信使中數量最多、種類最豐富的一類，主要與 G 蛋白偶聯受體（GPCRs）結合，廣泛存在于動物神經系統中，幾乎參與所有大腦功能，如調節代謝、發育、生殖以及行為、學習和動機狀態等生物過程。然而，由于繪制神經元間神經肽傳遞存在技術挑戰，人們對神經肽通路網絡的組織和相互作用了解甚少。不過，隨著技術進步，繪制神經肽相互作用和可視化體內神經肽活動成為可能，使人們對這些網絡的機制理解有了實驗基礎。

自 20 世紀 70 年代發現首個腦阿片受體以來，眾多肽激活受體被發現參與調節大腦功能。動物基因組通常編碼約 100 - 150 種不同的肽 GPCRs，編碼肽的基因也具有相似的多樣性。近年來，單細胞 RNA 測序和系統熒光報告研究極大地拓展了人們對神經肽和 GPCR 表達的理解，能夠在動物大腦中進行細胞分辨率的基因表達圖譜繪制。研究發現，神經肽和受體基因在神經系統中普遍表達，大多數神經元會表達多種神經肽和肽激活的 GPCRs，且組合方式往往因神經元細胞類型而異。這種復雜的組合表達模式在不同動物門類中都存在，表明肽網絡中的狀態和信息流是由多種神經肽的協同作用決定的。

通過整合單神經元轉錄組數據和肽 - 受體相互作用知識，可以預測神經元間的神經肽信號傳遞路徑，繪制出神經肽連接組。該連接組由代表單個神經元或細胞類型的節點構成，當細胞表達匹配的受體 - 配體對時，節點間通過邊相連。大規模反向藥理學研究為繪制神經肽網絡提供了助力，目前已成功構建了秀麗隱桿線蟲（C. elegans）、人類大腦、小鼠皮層、斑馬魚端腦、果蠅時鐘電路等的神經肽連接組。

秀麗隱桿線蟲是首個完成整個神經系統神經肽連接組構建的生物。其連接組顯示，神經肽網絡可能比已知的突觸連接組連接更緊密，神經元間相互作用多出 10 倍以上，且大多數神經肽通路介導突觸外相互作用。此外，秀麗隱桿線蟲神經肽連接組具有特定組織特征，如存在具有相似肽能連接性的神經元簇，部分中樞神經元在突觸和神經肽連接組中都存在，而有些則是神經肽連接組特有的。而且，不同神經肽 - 受體對的網絡拓撲結構多樣，包括局部網絡、廣播網絡和普遍網絡等。脊椎動物肽網絡也有類似拓撲結構，但不同網絡架構的功能意義尚待揭示。

對比不同物種基于表達的神經肽網絡，發現一些保守特征。肽網絡通常密度較高，表明動物大腦中大多數神經元細胞類型通過神經肽信號相互連接。神經肽通路普遍共表達，存在多種相互作用方式，如肽能串擾、收斂信號、發散信號、神經肽級聯反應和自分泌信號等。體內研究也證實了這些相互作用，例如激活肽 GPCRs 可調節同一神經元中其肽配體和 / 或其他神經肽的釋放。此外，受體 - 配體配對的混雜性也會導致肽能串擾。不過，目前尚不清楚神經肽是冗余的還是具有累積作用，未來可通過類似秀麗隱桿線蟲的組合突變庫表型分析策略來探究共表達神經肽和 GPCRs 的相互作用。

神經肽信號網絡的復雜性促使人們開發專門工具，以實現對神經肽傳遞的時空監測。由于缺乏特異性體內傳感器，確定基于表達的神經肽相互作用是否具有功能以及何時發揮功能一直頗具挑戰。近年來，多種直接監測神經肽傳遞的工具不斷涌現，推動了人們對神經肽信號的時間動態、釋放部位以及細胞整合等方面的理解。

在測量神經肽釋放方面，已開發出多種光學方法。例如，通過基因標記使肽攜帶 pH 敏感的熒光指示劑，可報告分泌小泡（DCVs）在胞吐過程中的 pH 變化，結合全內反射熒光（TIRF）顯微鏡技術，能夠時空分辨單個釋放事件。還有將神經肽標記熒光團激活蛋白（FAPs），使其與細胞外應用的膜不透性熒光團接觸后發出熒光，用于可視化果蠅大腦中 DCV 的胞吐作用。此外，一種不干擾內源性肽能信號的 DCV 釋放通用傳感器也已問世，它由連接在 DCV 特異性膜蛋白 CYB561 腔側的 pH 敏感 GFP 變體構成。這些工具對于解析肽網絡中神經肽釋放的時間動態和區域化非常有用，如研究發現果蠅時鐘神經元從神經末梢或胞體釋放神經肽的機制不同，進而控制節律行為的不同方面。

在研究神經肽與受體結合方面，基因工程改造的能報告肽結合的 GPCRs 為體內研究神經肽傳遞提供了多種工具�；�于熒光 GPCR 的傳感器可監測神經肽釋放后的傳播位置、距離和速度，有助于驗證基于表達的神經肽相互作用是否具有功能。這些傳感器通過在 GPCR 的細胞內環插入熒光蛋白構建而成，當與目標神經肽結合時，受體發生構象變化，導致熒光發射增強。目前已開發出針對多種神經肽的傳感器，如哺乳動物的食欲素、催產素、生長抑素、阿片類物質以及果蠅的短神經肽 F 等。這些傳感器靈敏度高、結合動力學快，可實時監測自由活動動物體內的內源性神經肽信號，例如利用催產素熒光 GPCR 傳感器發現了自由活動小鼠體內催產素水平的超晝夜振蕩以及交配過程中催產素肽的區域化釋放。此外，這些傳感器還能測量神經肽在細胞外空間的時空擴散，有研究表明神經肽可在數秒內到達距離釋放位點 100μm 以外的受體。

實時熒光 GPCR 傳感器雖能報告受體與肽配體的結合，但無法反映細胞內信號傳導。轉錄 GPCR 活性整合器則可通過將受體的細胞內信號級聯與轉錄報告基因的產生相耦合，標記 GPCR 被激活的細胞。具體來說，GPCR 的 C 末端通過煙草蝕紋病毒（TEV）蛋白酶切割位點與非天然轉錄因子融合，當配體激活受體后，與 β - 抑制蛋白（受體激活后招募的蛋白）融合的 TEV 蛋白酶靠近其靶序列，釋放轉錄因子，誘導報告基因表達。在黑暗中通過光敏感的 LOV 蛋白封閉 TEV 蛋白酶切割位點，可進一步提高時間分辨率。雖然該工具常用于監測培養細胞中的 GPCR 激活，但在體內研究神經調質信號傳導方面應用較少，不過其具有穩定報告大量細胞中受體激活的優勢，未來有望在進一步改進后更多地應用于體內研究。

監測 G 蛋白激活下游的第二信使（如鈣、環磷酸腺苷（cAMP）和二酰甘油）水平變化，是測量肽 - GPCR 信號功能反應的直接方法。目前，細胞質游離鈣是最常被記錄的第二信使，大量鈣成像研究揭示了神經肽通過影響神經活動調節大腦功能的多種方式。近期技術進展使得在自由活動動物中進行大體積鈣記錄并結合光學神經元刺激成為可能，研究發現神經肽信號對神經元群體動態有廣泛影響，可調節行為狀態下的持續神經活動模式，如小鼠的攻擊行為和秀麗隱桿線蟲的持續覓食狀態，還能在較短（< 秒）時間尺度上影響大規模群體動態。不過，由于測量其他第二信使（如 cAMP 和二酰甘油）的傳感器尚未在腦尺度上系統應用，目前對神經肽網絡對神經功能影響的了解可能仍低估了其實際作用。

將上述工具結合使用，可關聯神經肽作用的不同生理方面，甚至同時追蹤多種神經肽的作用。例如，一項研究同時使用實時 GPCR 和 cAMP 傳感器，發現下丘腦靶神經元整合了神經肽 Y 和 α - 促黑素細胞激素（αMSH）的隨機信號，通過對 cAMP 信號的相反作用來校準飽腹感速率。同時可視化多種神經肽和其他神經活性分子的作用，為剖析大腦回路中的信息處理提供了新方法，有助于深入理解神經肽網絡的機制和功能原理。

目前對基于表達的神經肽網絡的計算機模擬（in silico）和功能分析，大多將神經肽連接組視為疊加在神經解剖結構上的靜態結構，但實際上神經肽和受體表達的瞬時或持續變化會對這些網絡的結構和功能產生廣泛影響。

在發育過程中，神經肽網絡可能會發生重塑。在脊椎動物中，從出生到成年大腦經歷的廣泛功能和結構變化，伴隨著神經肽（如甘丙肽）表達的改變，這些變化有助于神經回路的成熟。在秀麗隱桿線蟲中，胚胎后神經系統發育過程中神經肽表達的時間調控，支撐著探索行為的時間轉變。

除了發育程序，神經肽表達還受經驗和性別影響。秀麗隱桿線蟲性別特異性基因表達圖譜顯示，許多神經肽和受體存在性別二態性表達，這在某些情況下決定了其在應激反應或聯想學習等行為中的性別特異性作用。神經元轉錄組也顯示，感官經驗或體內平衡破壞（如睡眠剝奪）會導致神經肽表達發生廣泛變化。雖然對這類肽能可塑性的網絡分析尚少，但可能有助于揭示肽網絡的適應性特征或核心保守元件。

對比不同物種的神經肽網絡也能獲得相關見解。神經肽基因表達可能快速進化，例如在密切相關的果蠅物種中，編碼色素分散因子（PDF）的神經肽基因的調控變化是晝夜節律可塑性進化的熱點。對三種秀麗隱桿線蟲物種神經系統的基因表達比較，也揭示了神經肽和受體表達的顯著進化變化模式。盡管在單個基因水平存在廣泛差異，但神經肽網絡的整體拓撲結構是保守的，不同物種中許多神經元間連接由不同的神經肽 - 受體對介導。這表明神經肽網絡結構與功能密切相關，即使神經肽信號適應不同生態需求，其核心功能的某些方面仍得以維持。隨著更多不同物種和情境下的轉錄組數據集出現，比較分析將進一步揭示肽網絡架構的共同原則。

近期的研究進展為理解神經系統的結構和功能開啟了新階段。神經肽回路被越來越多地視為動物大腦的基本組成部分，其廣泛的網絡在無脊椎動物和脊椎動物中均有繪制。神經肽不僅是生理和行為的重要調節因子，其幾乎連接所有神經元的特性，也凸顯了它們在神經系統功能中的重要作用，既作為調節快速神經遞質作用的調制信號，又在復雜行為中充當主要信息傳遞者。神經肽網絡的高密度表明其在控制回路活動和行為方面的重要作用，盡管在脊椎動物中對局部肽能回路的探索較少，但已有證據顯示其對學習等復雜行為至關重要。此外，神經肽系統在分子和功能上存在深度保守性。未來，進一步比較研究無脊椎動物和脊椎動物的神經肽網絡，有望揭示神經系統功能的基本原理。

當前主要挑戰之一是揭示密集神經肽網絡的運作原理。這需要將目前主要針對單一通路的功能研究擴展到網絡活動分析。新開發的針對不同肽和受體信號級聯的體內傳感器，結合神經肽信號圖譜，將有助于理解神經元如何處理具有相似或相反作用的同時存在的神經肽信號。未來系統探索神經肽 - 受體通路對細胞生理學影響的工作也將為此提供幫助。另外，考慮到肽能可塑性會改變網絡結構，研究哪些神經肽相互作用在何時可及也是關鍵。神經肽釋放報告器和基于 GPCR 的傳感器的發展，為研究神經肽信號的時空范圍相關過程（如區域化釋放、擴散和降解）提供了途徑。最終，將神經肽傳遞的時空模式與解剖結構、神經回路和行為相關聯的綜合方法和計算模型，將為揭示神經肽如何控制大腦內部狀態和行為帶來新的可能。