《Current Opinion in Genetics & Development》：To splice or not to splice: pseudoexons in neurological disease and opportunities for intervention
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這篇綜述聚焦神經系統疾病中假外顯子。闡述了前體 mRNA 剪接、剪接基序突變與疾病的關系，分析假外顯子的致病機制，介紹針對其的反義寡核苷酸（ASO）干預策略，探討了挑戰與機遇，為相關研究和治療提供參考。
引言
在人類遺傳疾病研究中，尋找致病突變時多關注編碼區突變。外顯子組分析雖能找到部分突變，但僅能為不到 60% 的患者提供答案。高達 30% 的疾病相關遺傳變異影響順式作用剪接基序，這些突變對剪接的影響因情況而異，還可能產生多種剪接變體，增加了致病性預測的難度。其中，激活假外顯子的突變尤其難以預測。攜帶假外顯子的轉錄本通常保留完整功能編碼序列，若能用剪接調節反義寡核苷酸（ASO）將假外顯子從成熟轉錄本中排除，有望生成正常功能的 mRNA，因此精準鑒定假外顯子突變可為靶向治療帶來機會。
前體 mRNA 剪接、剪接基序突變與疾病
多數人類基因含有內含子，轉錄后形成的前體 mRNA 需經過剪接過程，由剪接體去除內含子并連接外顯子�？勺兗艚幽墚a生多種轉錄本變體，增加基因表達和調控的復雜性。除規范外顯子邊界外的剪接被稱為 “隱蔽” 剪接，它可能是低頻未知功能事件、調控機制，也可能是突變的結果。
外顯子選擇和前體 mRNA 剪接受順式元件影響，這些元件能被剪接因子識別和結合。突變若改變或創建剪接基序，會影響前體 mRNA 加工和轉錄本結構，可能產生非規范外顯子。根據其產生原因和功能，非規范外顯子可分為假外顯子、隱蔽外顯子和毒外顯子等。假外顯子通常由內含子深處的單核苷酸變異激活，其激活機制與轉錄調控機制相關，如毒外顯子和遞歸剪接。遞歸剪接可逐步去除大內含子，單核苷酸變異若影響遞歸剪接區域的剪接基序，可能導致序列被選作假外顯子。
假外顯子與發病機制
假外顯子激活難以預測，是一種未被充分報道的疾病機制。這是因為激活假外顯子的突變類型多樣，且內含子深處的變異常被常規基因組分析遺漏或無法確定其意義。此外，含假外顯子的轉錄本常觸發無義介導的 mRNA 衰變（NMD），增加了檢測難度。
目前，基因組和轉錄組聯合分析、新型計算工具、患者來源細胞模型等技術的應用，有助于揭示疾病機制。通過分析全基因組配對 DNA - RNA 測序，可發現內含子深處剪接突變熱點，并對其致病性進行分類。
假外顯子與干預機會
ASO 是設計用于靶向結合 RNA 并調節基因表達的短核酸類似物。雖有潛力克服假外顯子突變，但針對神經發育障礙相關假外顯子或隱蔽外顯子的 ASO 策略較少。
Yamada 等人開發的 ASO 可促進致病性 WDR45 假外顯子的跳躍，用于治療發育遲緩及進行性運動障礙患者。針對 PCCA 丙酸血癥患者的突變，也開發出能減少假外顯子包含并恢復酶活性的 ASO，且該 ASO 無需跨越血腦屏障（BBB），可通過肝臟給藥。
在四氫生物蝶呤缺乏癥患者中，發現 PTS 基因的剪接變體，相關 ASO 能排除假外顯子并挽救蛋白表達。Shah 等人報道，針對 FMR1 基因中導致脆性 X 綜合征的假外顯子的 ASO，可抑制剪接并增加 FMRP 水平，揭示了剪接與轉錄終止信號識別之間的新關系。
Stoke Therapeutics 公司的 STK - 001/Zorevunersen 2′ - MOE ASO 可減少 Dravet 綜合征相關毒外顯子的自然包含，增加 SCN1A 有效轉錄本水平，降低癲癇發作頻率，且該方法不依賴特定突變。
異常 mRNA 是神經退行性疾病的標志，TARDBP 突變會導致剪接嚴格性降低，增加隱蔽外顯子的包含，引起細胞應激和神經退行性變。針對 STMN2 基因隱蔽外顯子的 ASO（QRL - 201）可糾正剪接，目前正在進行 I 期臨床試驗。此外，針對 UNC13A 基因中與疾病風險相關的隱蔽外顯子的 ASO，可挽救 UNC13A 表達并恢復功能。
結論
假外顯子作為治療靶點，為中樞神經系統（CNS）疾病的 RNA 治療帶來機遇與挑戰。大腦具有獨特的基因表達模式和神經元特異性可變剪接事件，神經元等長壽命細胞對異�；虮磉_敏感。ASO 可調節目標前體 mRNA，產生正常功能轉錄本，這是小分子或基因替代療法難以實現的。
目前已發現一些激活假外顯子的反復突變，針對這些突變開發的剪接糾正療法有望治療多名患者。如針對 COL6A1 基因和 TIMMDC1 基因相關突變的治療策略已取得一定成果。
然而，BBB 限制了核酸療法在 CNS 疾病中的應用，多數 ASO 無法通過 BBB，需采用鞘內注射等方式，但這種方式存在分子分布復雜等問題。此外，CNS 神經元再生能力有限，要求治療藥物毒性極低。同時，ASO 向靶細胞的遞送效率低、針對小群體定制 ASO 策略成本高，也阻礙了核酸療法的廣泛應用。不過，學術、非營利組織和特殊利益團體正在開展針對罕見病的 n-of-1 研究，相關監管指南也將推動 ASO 藥物在罕見病治療領域的發展。
