《Brain Research》：Method for cryopreservation of brainstem pons and medulla oblongata tissue from Sprague Dawley rats for establishing primary mixed neuron-glia cell cultures
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在研究三叉神經相關口面部疼痛疾�。ㄈ缙^痛、顳下頜關節紊亂病等）時，傳統建立原發性腦干組織培養的方法存在諸多問題。研究人員開展了大鼠腦干組織冷凍保存研究，結果顯示冷凍保存細胞培養物與新鮮培養物相似。該研究為相關研究提供便利，意義重大。
在口面部疼痛領域，偏頭痛、顳下頜關節紊亂�。═MD）、過敏性鼻炎以及三叉神經痛等病癥一直困擾著眾多患者。這些疾病的發病機制與三叉神經的激活以及后續的炎癥和傷害性防御反應密切相關。三叉神經的三個主要分支 —— 眼支（V1）、上頜支（V2）和下頜支（V3），負責頭面部的感覺神經支配，它們不僅傳遞疼痛刺激，還傳遞本體感覺信息。而位于腦干中的三叉神經核，尤其是脊髓三叉神經核，在感受頭面部有害刺激、介導保護性退縮反應以及促進中樞敏化發展中起著關鍵作用。
中樞敏化是口面部疼痛病癥的關鍵病理特征，會導致痛覺過敏和異常性疼痛。在腦橋和延髓水平，參與建立和維持中樞敏化的主要細胞包括二級神經元、星形膠質細胞、小膠質細胞和少突膠質細胞。這些細胞的敏化和激活涉及多個信號轉導通路，比如降鈣素基因相關肽（CGRP）與受體結合后，會激活蛋白激酶 A（PKA），進而促進絲裂原活化蛋白激酶（MAP 激酶）JNK 和 p38 的活性形式表達，引發炎癥反應、增強疼痛信號傳導并促進中樞敏化。此外，信號分子 ATP 通過激活嘌呤能受體，使細胞內鈣升高，也參與了神經元 / 膠質細胞的激活和中樞敏化過程。同時，MAP 激酶磷酸酶 MKP - 1 和 GABA 能蛋白等則在維持體內平衡、抑制中樞敏化方面發揮重要作用。
為了深入研究這些復雜的生化、細胞和分子機制，傳統的方法是利用原發性神經元和膠質細胞培養物進行體外研究。然而，傳統的從嚙齒動物胚胎或新生動物制備原發性培養物的方法存在諸多弊端，既耗費人力，又難以保證培養物的質量一致性。這就好比在建造高樓時，使用的建筑材料質量參差不齊，難以保證高樓的穩固和安全。在這種情況下，冷凍保存技術成為了研究人員的新希望。
密蘇里州立大學的研究人員開展了一項旨在開發高效可靠的冷凍保存方法的研究，他們的目標是對新生 Sprague Dawley 大鼠的腦干腦橋和延髓組織進行長期冷凍保存，以建立用于生化、細胞和分子研究的原發性混合神經元 - 膠質細胞培養物。最終，他們成功找到了一種簡化的冷凍保存方法，使用 90:10（v/v）的胎牛血清 / 二甲基亞砜細胞冷凍培養基。研究發現，在液氮中儲存長達一年的冷凍保存腦干細胞，與新鮮培養物相比，神經元和膠質細胞的形態、細胞比例以及活力相似。而且，神經元和膠質細胞中參與疼痛信號傳導和中樞敏化的蛋白質表達，與已報道的亞細胞定位相符，在 ATP 刺激下，神經元和膠質細胞內鈣水平升高。
這項研究成果發表在《Brain Research》上，具有重要意義。它為相關疾病的研究提供了標準化、高質量的細胞資源，極大地提高了研究的可重復性。就像有了一把精準的鑰匙，可以更準確地打開疾病機制研究的大門。同時，該方法無需特殊設備或試劑，節省了實驗室的時間和資金等資源，還減少了研究中實驗動物的使用數量，為科研工作帶來了諸多便利，推動了口面部疼痛疾病研究的發展。
研究人員在開展此項研究時，主要運用了以下關鍵技術方法：首先是細胞培養技術，包括從新生 Sprague Dawley 大鼠獲取腦干腦橋和延髓組織進行細胞培養；其次是冷凍保存技術，利用特定的冷凍培養基對細胞進行冷凍保存；還有細胞染色和成像技術，通過核染料 DAPI 染色和成像來識別細胞類型。
細胞類型和形態在新鮮和冷凍保存的原代培養物中的研究結果
通過對比發現，使用冷凍保存細胞建立的新生大鼠腦干腦橋和延髓組織的原代培養物，與新鮮制備的過夜培養物相比，細胞類型相同，形態相似。在培養 7 天的腦干培養物中，主要識別出四種細胞類型，即星形膠質細胞、小膠質細胞、少突膠質細胞和神經元。
研究結論和討論
本研究成功開發了一種高效且可靠的冷凍保存新生 Sprague Dawley 大鼠腦干組織的方法，用于建立原發性混合神經元 - 膠質細胞培養物。這種方法能夠獲得與新鮮培養物相似的細胞培養物，為研究三叉神經相關口面部疼痛疾病的病理和治療機制提供了有力工具。利用該方法建立的原發性細胞培養物，可在進行更昂貴、耗時的體內研究之前，幫助研究人員更好地理解生化、細胞和分子機制，有助于確定新的分子靶點，對推動口面部疼痛疾病的研究和治療具有重要意義。它不僅解決了傳統原發性培養方法的難題，還為科研工作者提供了更靈活、高效的研究手段，為未來攻克相關疾病奠定了堅實基礎。
