《Biological Psychiatry Global Open Science》：Autism-Associated PTCHD1 Missense Variants Bind to the SNARE-Associated Protein SNAPIN but Exhibit Impaired Subcellular Trafficking
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為解決 PTCHD1 功能及相關錯義變體臨床意義不明的問題，研究人員開展 PTCHD1 與突觸蛋白互作及錯義變體功能研究。結果發現 PTCHD1 與 SNAPIN 互作，部分錯義變體不影響結合但有亞細胞轉運缺陷。這為診斷和變體解讀提供依據。
在神經發育的神秘領域中，自閉癥譜系障礙（ASD）和智力殘疾（ID）一直是困擾科學界和醫學界的難題。遺傳因素在 ASD 和 ID 的發病機制中起著關鍵作用，眾多研究致力于尋找相關的致病基因。PTCHD1 基因，位于 Xp22.11，自 2008 年被發現與 ASD 和 ID 的發病機制有關后，便成為研究焦點。然而，盡管發現了許多 PTCHD1 的罕見基因組缺失變體、功能喪失編碼變體以及大量錯義變體，但 PTCHD1 在大腦發育和神經傳遞中的具體功能依舊撲朔迷離。
更為棘手的是，臨床診斷中發現的大量 PTCHD1 錯義變體，由于缺乏功能信息，大多被歸類為意義未明的變體（VUSs）。這一現狀嚴重限制了為患者和家庭提供的醫療資源，使得他們難以獲得精準的診斷和有效的遺傳咨詢。為了突破這些困境，研究人員踏上了探索 PTCHD1 奧秘的征程。雖然文中未提及具體研究機構，但他們圍繞 PTCHD1 展開了一系列深入研究，相關成果發表在《Biological Psychiatry Global Open Science》上。
研究人員運用了多種關鍵技術方法來揭開 PTCHD1 的神秘面紗。首先，采用酵母雙雜交（yeast 2-hybrid）實驗，篩選與 PTCHD1 相互作用的突觸蛋白；接著，通過克隆技術獲取相關基因構建表達載體；然后利用共免疫沉淀（co-immunoprecipitation）和免疫印跡（immunoblotting）驗證蛋白間的相互作用；免疫細胞化學（immunocytochemistry）技術則用于觀察蛋白的亞細胞定位；此外，還運用定點突變（site-directed mutagenesis）評估臨床錯義變體的致病性。研究中使用了多個樣本隊列，如 Autism Speaks/MSSNG 數據集和 DECIPHER 數據集，為研究提供了豐富的數據支持。
研究結果
- 發現 PTCHD1 與 SNAPIN 的新相互作用：研究人員利用酵母雙雜交實驗，以 PTCHD1 的腔環 1 或腔環 1 與腔環 2 的融合蛋白作為誘餌，篩選互補 DNA（cDNA）文庫。結果驚喜地發現，PTCHD1 的腔環 1 與 SNARE 相關蛋白 SNAPIN 存在強烈的相互作用。后續通過共免疫沉淀實驗進一步證實，小鼠 Snapin 與小鼠 Ptchd1 腔環 1 相互作用較強，與腔環 1 - 腔環 2 融合蛋白相互作用較弱。免疫細胞化學實驗顯示，在 P19 誘導的神經細胞中，PTCHD1 和 SNAPIN 在樹突突起中共定位。這一發現揭示了 PTCHD1 新的相互作用蛋白，為理解其功能提供了新線索。
- 臨床變體與 Snapin 的結合情況：研究人員對文獻、臨床基因組數據庫及臨床醫生提供的 PTCHD1 單核苷酸變體進行研究。通過在 HEK293T 細胞中進行共免疫沉淀實驗，發現所有評估的腔環變體在蛋白質水平均可檢測到，且都能與 Snapin 相互作用。不過，部分變體如 p.Pro75Leu、p.Pro75Gln、p.Val195Ile、p.Tyr213Cys 和 p.Phe549Cys 的單體蛋白表達水平相較于野生型（WT）Ptchd1 有所降低。這表明這些臨床變體雖然不影響與 Snapin 的結合，但可能在其他方面影響 PTCHD1 的功能。
- 臨床變體的亞細胞定位異常：在 HEK293T 細胞中，研究人員發現 6 個腔環點突變體（p.Pro75Leu、p.Pro75Gln、p.Val195Ile、p.Tyr213Cys、p.Asp527Glu 和 p.Phe549Cys）與野生型相比，在內質網（ER）中的滯留增加，其中 p.Pro75Leu 和 p.Pro75Gln 與 ER 標記蛋白鈣網蛋白（CNX）的關聯分別比野生型高 75% 和 84%。同時，除 p.Asp527Glu 外，這些變體在細胞膜中的定位均減弱，如 p.Tyr213Cys 和 p.Phe549Cys 與細胞膜標記蛋白 ATP1A1 的共定位分別比野生型減少 67% 和 68%，p.Pro75Leu 和 p.Pro75Gln 與 ATP1A1 的共定位分別減弱 43% 和 42%。在神經元系統（Neuro - 2a 細胞）中，野生型 Ptchd1 定位于神經元突起，而部分變體（如 p.Pro32Arg、p.Pro75Gln、p.Val150Met、p.Tyr213Cys、p.Gly303Arg 和 p.Phe549Cys）僅局限于細胞體，無法轉運到神經元突起；另有部分變體（如 p.Ser51Asn、p.Gln102Arg、p.Val195Ile 和 p.Asp527Glu）則能正常轉運到細胞膜和樹突，呈現出與野生型相似的點狀模式。這說明不同的 PTCHD1 錯義變體在神經元和非神經元細胞中的亞細胞定位存在差異，影響其正常功能。
研究結論與討論
綜合研究結果，研究人員成功鑒定并驗證了 PTCHD1 的新相互作用伙伴 SNAPIN，且發現選定的腔環臨床錯義變體不會破壞這種相互作用。然而，部分錯義變體在內質網滯留并損害了其在神經元中的質膜定位，這為一些錯義變體的病理機制提供了新的解釋，即蛋白質錯誤折疊介導的聚集和在內質網的滯留，以及隨后受損的樹突膜轉運，導致突觸后密度（PSD）處可利用的 PTCHD1 不足。同時，研究也存在一定局限性，如酵母雙雜交實驗可能存在假陽性結果，HEK293T 細胞作為非神經元模型對研究結果的神經病理學可翻譯性存在影響等。盡管如此，該研究依舊為未來的診斷檢測和遺傳診斷學家對 PTCHD1 VUSs 的解讀提供了重要平臺。后續研究可進一步明確 PTCHD1 對 SNAPIN 介導的突觸小泡胞吐作用的影響，深入探究 PTCHD1 的內源性相互作用蛋白網絡，以及運用更敏感的生化技術量化 PTCHD1 錯義變體的穩定性，從而更全面地揭示 PTCHD1 在神經發育和神經傳遞中的作用機制，為自閉癥和智力殘疾的診斷和治療帶來新的希望。
