《Bioelectrochemistry》：Electrochemical detection of superoxide anion in living systems: Recent trends and clinical implications
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這篇綜述聚焦生物系統中超氧陰離子（O2?ˉ）的電化學檢測。詳細探討了檢測方法，包括酶促和非酶促檢測及其優劣勢，還介紹了體外和體內檢測策略，闡述其在氧化應激監測和疾病診斷中的臨床意義，為相關研究提供全面參考。
1. 引言
超氧陰離子（O2?ˉ）作為一種活性氧物種，在生物系統中具有重要作用。它由分子氧的單電子還原產生，在吞噬細胞防御機制和細胞呼吸過程中發揮關鍵作用。適量的 O2?ˉ參與細胞信號傳導，但當其積累時，會引發氧化應激，導致蛋白質、細胞和組織受損，與多種疾病相關，如神經退行性疾病、動脈粥樣硬化和心血管疾病等。
傳統檢測 O2?ˉ的方法存在諸多局限性，如電子順磁共振光譜（EPR）需使用自旋捕獲劑，且在生理條件下靈敏度受限；熒光探針檢測存在信號重疊問題；高效液相色譜（HPLC）雖能降低檢測限，但成本高、操作復雜，難以用于活細胞或組織的動態監測。相比之下，電化學技術具有成本低、操作簡便等優勢，能夠實現對活性氧物種的檢測和動態監測，因此在生物系統中 O2?ˉ的檢測研究中受到廣泛關注。
2. 超氧陰離子檢測：電化學視角
O2?ˉ可通過分子氧在負電位下的還原反應電化學產生，但在水溶液環境中穩定性差，且其還原過程與過氧化氫的電活性相近，難以區分。因此，在電化學檢測中，需要選擇合適的 O2?ˉ來源，如堿性二甲基亞砜、酚類衍生物的原位氧化或堿金屬超氧鹽（如 KO2）等，同時要注意避免測量干擾。此外，通過酶促反應（如黃嘌呤氧化酶催化次黃嘌呤 / 黃嘌呤轉化為尿酸的過程）產生 O2?ˉ，可實現穩態下的精確檢測，但該方法存在成本較高的問題。
電化學檢測 O2?ˉ的策略主要分為酶促檢測和非酶促檢測，電極表面修飾對檢測方法的選擇性和靈敏度起著關鍵作用。
2.1 酶促檢測
酶基生物傳感器利用酶對特定底物的高靈敏度進行檢測。在 O2?ˉ電化學檢測中，常用的酶有細胞色素 c（cyt c）和超氧化物歧化酶（SOD）。
cyt c 是參與電子傳遞鏈的小血紅素蛋白，也具有抗氧化酶的功能。它能與 O2?ˉ反應生成氧氣和還原型 cyt c，通過監測 Fe2+-cyt c 在電極上氧化的氧化還原電流，可實現對 O2?ˉ的定量檢測。例如，將 cyt c 通過物理吸附或共價結合的方式固定在電極表面，可制備 cyt c 基生物傳感器。為提高傳感器的靈敏度，可使用納米材料或納米結構表面，如納米多孔金網，能增大酶固定化的表面積，促進電子轉移，降低檢測限。
SOD 是催化 O2?ˉ歧化反應的高效酶，相比 cyt c，它具有更高的催化效率和穩定性，能更有效地保護細胞免受氧化應激。SOD 基生物傳感器的檢測策略通常是通過識別 O2?ˉ酶促歧化反應的產物（如過氧化氫）的電活性，或利用 SOD 與 O2?ˉ相互作用時金屬陽離子氧化態和電荷的變化，實現直接電信號檢測。不同的 SOD 固定化策略會影響傳感器的性能，如通過生物聚合物封裝、交聯或碳二亞胺化學法將 SOD 固定在電極表面，可提高傳感器的靈敏度和穩定性。
2.2 非酶促檢測
為避免酶促生物傳感器的一些缺點，如蛋白質變性、重復性下降和操作條件受限等，研究人員開發了多種用于 O2?ˉ電化學檢測的功能性合成材料。
納米技術在新型傳感表面的設計中發揮了重要作用。例如，碳納米結構（如空心立方碳或多孔立方碳網絡）能增加傳感表面積，提高電子轉移速率；貴金屬納米材料（如 Ag 或 Au 納米顆粒）也可用于 O2?ˉ的催化檢測，但部分材料存在檢測電位高、信號區分困難或納米顆粒聚集等問題。
此外，過渡金屬基功能材料作為低成本的人工酶也被廣泛研究。這些材料模擬天然酶的活性位點，與 O2?ˉ發生化學反應，然后通過電化學氧化或還原金屬中心實現信號讀出。其中，錳磷酸鹽（Mnx(PO4)y）和鈷磷酸鹽（Co3(PO4)2）等過渡金屬磷酸鹽納米結構因其穩定性和選擇性而受到關注，但它們的合成過程較為復雜。為解決這些問題，研究人員探索了多種合成方法，如微乳液法、原位合成法以及利用生物分子或 DNA 模板輔助合成等。
2.3 酶促檢測與非酶促檢測的優勢與局限
酶促生物傳感器具有高特異性、生物相關性適合體內應用、靈敏度高、可重復使用以及實時快速響應等優勢。其高特異性可減少其他活性氧物種或分子的干擾，確保 O2?ˉ檢測的準確性；生物相關性使其在體內檢測和臨床診斷中具有重要價值；高靈敏度有助于檢測低濃度的 O2?ˉ；可重復使用性降低了長期使用成本；實時快速響應則能滿足對 O2?ˉ動態監測的需求。然而，酶促生物傳感器也存在酶穩定性差和重復性隨時間下降的問題。
非酶促傳感器的優勢在于穩定性和耐久性好、制備簡單且成本效益高、操作條件寬泛、檢測通用性強。它們不依賴生物酶，避免了酶的不穩定性問題，可在惡劣環境下長期使用；簡單的制備過程和較低的成本使其更具經濟優勢；寬泛的操作條件使其適用范圍更廣；能夠檢測多種活性氧物種，使其在氧化應激檢測等領域具有更廣泛的應用潛力。但非酶促傳感器存在選擇性低和生物相容性差的缺點，不過使用 DNA 模板材料可提高其生物相容性。
3. 體外策略
電化學檢測在活細胞系統基礎研究中具有操作簡單、能在單細胞或細胞培養環境中監測動態生物過程的優勢。在體外實驗中，對 O2?ˉ的研究主要集中在監測外部物質的抗氧化性能、探索細胞死亡過程中局部 O2?ˉ的產生以及動態監測細胞在物理或化學刺激下釋放的 O2?ˉ。
通過檢測活細胞培養中伏安或安培信號的變化，可監測食物中抗氧化劑（如茶多酚、維生素 C、β - 胡蘿卜素和花青素等）對 O2?ˉ釋放的影響，評估其抗氧化性能。在癌癥研究中，利用電化學方法監測刺激細胞釋放的 O2?ˉ，可區分健康細胞和癌細胞，研究癌細胞在高脈沖電場（PEF）下的 ROS 生成以及與細胞內 Ca2+釋放的關系，為癌癥治療提供理論依據。
此外，研究不同刺激（如缺氧、紫外線暴露、溫度變化、化學物質刺激等）對活細胞 O2?ˉ釋放的影響，有助于深入了解細胞的生理和病理過程。例如，通過監測細菌在抗生素刺激下釋放的 O2?ˉ，研究抗生素的作用機制；通過監測細胞在不同溫度下對化學刺激的響應，評估細胞的抗氧化能力和對溫度的耐受性。
為提高檢測準確性和細胞相容性，研究人員采用了多種策略。如將活細胞直接植入傳感表面，可監測特定膜位置的事件，但需考慮材料的生物相容性；使用 2D 和 3D 材料可促進細胞黏附和生長，避免細胞生長和增殖問題；通過芯片設計和微型化配置，結合敏感和選擇性傳感表面與細胞培養瓶，可實現對細胞生長過程中 O2?ˉ的直接監測。
4. 體內策略
體外實驗雖然能揭示細胞應激和死亡的生物學途徑，但體內策略能更好地在復雜的生化反應級聯中區分感興趣的途徑。將體外具有優異分析性能的電化學檢測方法應用于體內時，需要考慮傳感器的微型化、操作參數的優化以及避免對活組織造成損傷等問題。
在體內檢測中，污垢效應會嚴重影響 ROS 的檢測。使用碳纖維、鉑電極和可滲透涂層等材料可減少污垢效應。例如，用 [Fe (im) 2 (tpp)] Br 修飾的碳棒可用于監測內毒素血癥大鼠循環血液中的 O2?ˉ；MUA 修飾的金電極可用于檢測大鼠腿部組織缺血再灌注過程中的 O2?ˉ。
酶促生物傳感器憑借其快速的動力學反應機制和低操作過電位，在體內 O
