《npj Parkinson's Disease》：Emergent glutamate & dopamine dysfunction in VPS35(D620N) knock-in mice and rapid reversal by LRRK2 inhibition
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帕金森�。≒D）目前缺乏有效治療手段。為探究其病理機制，研究人員以 VPS35D620N敲入（VKI）小鼠為模型開展研究。結果發現 VKI 小鼠紋狀體神經傳遞增加，多巴胺功能障礙可被 LRRK2 抑制快速逆轉。這為 PD 治療提供新思路12。
帕金森病，一個令無數患者和家屬備受折磨的 “健康殺手”，一直以來都嚴重影響著人們的生活質量。它主要表現為運動障礙，根源在于黑質致密部（SNpc）的多巴胺神經元死亡。在臨床癥狀出現后的約 4 年時間里，黑質紋狀體多巴胺軸突標記物幾乎完全喪失 ，不過黑質神經元的損失相對沒那么嚴重，僅為 30 - 60%，且之后保持相對穩定。目前，雖然多巴胺替代療法（如左旋多巴，L - DOPA）能在一定程度上緩解運動癥狀，但卻沒有任何一種治療方法可以真正減緩或阻止帕金森病的病情進展。更糟糕的是，許多在運動功能障礙出現前數年就存在的癥狀，像快速眼動（REM）睡眠行為障礙、嗅覺喪失、便秘、情緒變化以及認知能力下降等，對 L - DOPA 治療根本沒有反應。此外，除了黑質多巴胺神經元，帕金森病還會導致許多其他神經元群體發生退化，這充分表明多種神經遞質系統都與帕金森病的早期癥狀表現和疾病進展密切相關。
為了深入探究帕金森病的發病機制，來自麥吉爾大學（The Neuro, McGill University）等多個研究機構的研究人員展開了一項重要研究。他們將目光聚焦在 VPS35D620N敲入（VKI）小鼠身上，這種小鼠表達與臨床典型帕金森病相關的 VPS35D620N變體，可模擬人類帕金森病在老年時的病理變化，非常適合用于早期病理生理機制的研究。
研究人員運用了多種技術方法來開展此項研究。在動物模型構建方面，他們按照既定方法培育并維持 VPS35D620N敲入小鼠在 C57Bl6/J 野生型背景下。實驗動物選用 1 - 6 個月大的雄性雜合子 VKI 和野生型（WT）小鼠 。在檢測神經傳遞變化時，運用了全細胞膜片鉗技術記錄自發和光遺傳誘發的谷氨酸傳遞；通過 iGluSnFR 成像和 dLight 成像分別測量總紋狀體谷氨酸釋放和紋狀體多巴胺釋放。為了探究 LRRK2 激酶抑制的作用，對小鼠進行急性 LRRK2 激酶抑制處理，并通過 Western blot 檢測相關蛋白變化 ，同時利用統計分析方法對實驗數據進行嚴謹處理。
研究結果如下：
- VKI SPNs 的自發活動變化：通過全細胞膜片鉗技術對不同月齡 VKI 和 WT 小鼠的 SPNs 進行檢測，發現 1 月齡時，兩者自發興奮性突觸后電流（sEPSCs）相似；3 月齡起，VKI sEPSCs 開始與 WT 出現差異，幅度增大；到 6 月齡時，VKI sEPSCs 的幅度和頻率顯著升高，且膜時間常數在 3 月齡時更快，6 月齡時恢復到 WT 水平 。同時，1 月齡 VKI SPNs 的膜 tau 蛋白減少，3 月齡時恢復正常，3 - 6 月齡時膜電容有增加趨勢，6 月齡時膜電阻降低 。這表明 VKI SPNs 的被動膜特性隨年齡發生變化，自發谷氨酸傳遞逐漸增強。
- 皮質紋狀體谷氨酸傳遞的變化：在 3 月齡和 6 月齡時對 VKI 小鼠進行光遺傳刺激谷氨酸釋放實驗。3 月齡時，VKI 小鼠的 AMPA 受體（AMPAR）和 N - 甲基 - D - 天冬氨酸受體（NMDAR）介導的電流幅度、NMDA:AMPA 電流比值及 AMPAR 整流指數與 WT 小鼠相比均無變化；6 月齡時，VKI 小鼠的 AMPAR 和 NMDAR 電流均顯著升高，但 NMDA:AMPA 比值和 AMPAR 整流指數仍無變化 。此外，6 月齡 VKI 小鼠的成對脈沖比率（PPR）顯著降低，表明其突觸前釋放概率增加。由此可見，6 月齡時 VKI 小鼠皮質紋狀體谷氨酸傳遞相對于 WT 小鼠明顯增強。
- 總紋狀體谷氨酸釋放的變化：利用 iGluSnFR 成像檢測發現，3 月齡 VKI 小鼠總紋狀體谷氨酸釋放顯著降低，6 月齡時恢復到與 WT 小鼠相似的水平 。而且，WT 小鼠 iGluSnFR 瞬變幅度存在年齡依賴性降低，而 VKI 小鼠沒有這種變化，僅 VKI 小鼠紋狀體 iGluSnFR 反應的衰減在 3 - 6 月齡間隨年齡顯著增加 。這說明 VKI 小鼠總紋狀體谷氨酸釋放在 3 月齡時減少，6 月齡時相對增加。
- 紋狀體多巴胺釋放的變化：通過 dLight 熒光報告基因測量發現，3 月齡 VKI 小鼠紋狀體多巴胺釋放與 WT 小鼠相比，除了脈沖串刺激后的恢復能力顯著降低外，其他指標無明顯變化；6 月齡時，VKI 小鼠紋狀體 dLight 反應峰值顯著增加 ，脈沖串刺激后的恢復能力在不同時間間隔呈現不同變化，短間隔時降低，長間隔時增加 。這表明 6 月齡時 VKI 小鼠紋狀體多巴胺釋放相對于 WT 小鼠明顯增加。
- 急性 LRRK2 激酶抑制的作用：對 6 月齡 VKI 小鼠進行急性 LRRK2 激酶抑制實驗，發現 MLi - 2 處理后，VKI 小鼠紋狀體多巴胺釋放顯著降低，恢復到 WT 水平，且不影響多巴胺轉運體（DAT）功能相關參數（如衰減常數、4s 間隔 PPR） 。然而，MLi - 2 處理對 WT 和 VKI 小鼠的谷氨酸能傳遞均無影響 。這說明急性 LRRK2 激酶抑制可特異性逆轉 6 月齡 VKI 小鼠紋狀體多巴胺釋放增加的現象，且這種作用獨立于 DAT 和 D2 受體活性。
綜合研究結果與討論部分，此次研究意義重大。研究人員發現 VKI 小鼠在年輕成年期紋狀體谷氨酸和多巴胺傳遞逐漸增加，其中多巴胺功能障礙很可能是由持續的、可快速逆轉的 LRRK2 過度活躍導致的 。這一發現為帕金森病的病理機制提供了新的見解，并且表明 LRRK2 抑制可能是對抗帕金森病突觸功能障礙的有效策略，為未來帕金森病的治療提供了潛在的新方向，有望開發出更有效的治療方法，改善患者的生活質量。
