《Cancer Immunology, Immunotherapy》：GD2-CAR NK-92 cell activity against neuroblastoma cells is insusceptible to TIGIT knockout
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為解決神經母細胞瘤（NB）免疫治療難題，研究人員開展 PVR/PVRL2 - TIGIT 軸及 GD2 - CAR NK - 92 細胞相關研究。結果顯示，該軸雖有潛力，但敲除 TIGIT 不能增強 GD2 - CAR NK - 92 細胞毒性。這為 NB 免疫治療提供新思路。
在兒童癌癥的世界里，神經母細胞瘤（Neuroblastoma，NB）是個讓人頭疼的 “大反派”。它是兒童最常見的顱外實體腫瘤，在 15 歲以下患者的惡性腫瘤中占比超過 8 - 10% ，高�；颊叩纳媛蔬�不到 45%。更糟糕的是，50 - 60% 的患者在治療后會復發，5 年生存率低于 20%。目前針對高危 NB 的免疫治療，比如使用靶向神經節苷脂 GD2 的單克隆抗體 Dinutuximab，雖然有一定效果，還成了標準療法，但不僅效果有限，還會帶來像神經性疼痛這樣嚴重的副作用。而 GD2 - 嵌合抗原受體（Chimeric antigen receptor，CAR）T 細胞療法雖然在 NB 患者身上沒這些副作用，還提高了復發或難治性高危 NB 患者的生存率，可還有提升空間。
腫瘤細胞很狡猾，會在自己表面弄出一些配體，構建出免疫抑制微環境，阻礙免疫細胞發揮作用。其中一個重要的免疫逃逸機制，就是腫瘤細胞表面的配體和免疫細胞上的抑制性檢查點蛋白結合，讓免疫細胞沒法好好工作，產生不了足夠的抗癌免疫反應。這時候，免疫檢查點（Immune checkpoint，IC）抑制劑療法出現了，像阻斷細胞毒性 T 淋巴細胞相關蛋白 4（Cytotoxic T lymphocyte - associated protein 4，CTLA - 4）、程序性細胞死亡蛋白 1（Programmed cell death protein 1，PD - 1）及其配體 1（PD - L1）等，能重新激活細胞毒性免疫細胞，對抗腫瘤。不過，只有部分癌癥患者對這些療法有反應，所以探索其他 IC 軸很有必要。
最近，涉及脊髓灰質炎病毒受體（Poliovirus receptor，PVR，CD155）、脊髓灰質炎病毒受體樣 2（Poliovirus receptor - like 2，PVRL2，CD112）和含免疫球蛋白和免疫受體酪氨酸抑制基序結構域的 T 細胞免疫受體（T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains，TIGIT）的 IC 軸，成了癌癥免疫治療的新希望，在急性髓系白血病等多種惡性腫瘤中都被證明很重要，在 NB 中也被認為是潛在的免疫治療靶點。
為了深入了解這個 IC 軸在 NB 中的作用，以及 GD2 - CAR NK - 92 細胞和基于 CRISPR 的 TIGIT 基因敲除聯合治療 NB 的效果，德國漢堡兒童癌癥中心研究所、漢堡 - 埃彭多夫大學醫學中心兒科干細胞移植和免疫學部門的 Wiebke Jünemann、Isabelle Bley 等研究人員展開了研究，相關成果發表在《Cancer Immunology, Immunotherapy》上。
研究人員主要用到了以下幾種關鍵技術方法：一是利用已有的 RNA - seq 數據，分析 NB 細胞系和患者樣本中相關分子的表達情況；二是使用 CRISPR/Cas9 系統構建 PVR、PVRL2 和 TIGIT 單敲除和雙敲除細胞系；三是通過慢病毒轉導等技術制備 GD2 - CAR NK - 92 細胞；四是運用流式細胞術檢測細胞表面分子表達、細胞毒性、脫顆粒和細胞因子分泌等情況。
下面來看具體的研究結果：
- PVR 和 PVRL2 作為潛在的 IC 分子：通過分析已有的 RNA 測序數據，發現 NB 細胞系中 PVR、PVRL2 和 B7 - H3 的表達比 PD - L1、HVEM 和 B7 - H4 高。分析患者樣本數據發現，高 PVR 表達與患者無事件生存率降低顯著相關，高 PVRL2 表達雖與無事件生存率降低有關，但不具有統計學意義。高 PVR 表達還會降低總生存率，而高 PVRL2 表達與較高的總生存率相關。在不同風險組的患者中，情況也有所不同。通過流式細胞術檢測多種 NB 細胞系表面 PVR 和 PVRL2 的蛋白表達，根據表達情況選擇了 LAN - 1、SK - N - LO 和 SH - EP 細胞系用于后續實驗。
- 基于 CRISPR/Cas9 的 NB 細胞系中 PVR 和 PVRL2 的有效敲除：用 CRISPR/Cas9 技術對 SK - N - LO、SH - EP 和 LAN - 1 細胞系進行基因編輯，篩選出單克隆細胞，獲得了單敲除和雙敲除克隆。經檢測，這些克隆細胞表面相應的 IC 分子完全缺失。但細胞毒性實驗表明，敲除 PVR 或 PVRL2 并沒有增強 NK - 92 細胞對 NB 細胞的裂解作用。研究人員還檢測了 NB 細胞上其他與 TIGIT 相互作用的受體，發現 Nectin - 4 在三種 NB 細胞系中均不表達，Nectin - 3 在野生型 NB 細胞中均為陽性，在 SH - EP 和 LAN - 1 細胞中，敲除 PVR、PVRL2 或兩者后其表達不變，而在 SK - N - LO 細胞中，敲除 PVR 或 PVRL2 會導致 Nectin - 3 表達缺失。
- NK - 92 細胞上 PVR 和 PVRL2 相互作用伙伴的表達：通過流式細胞術檢測發現，NK - 92 細胞不表達激活受體 DNAX 輔助分子 1（DNAX accessory molecule - 1，DNAM - 1，CD226），高表達抑制受體 TIGIT ，PD - 1 和 CTLA - 4 表達頻率很低。而健康供體的原代 NK（pNK）細胞不表達 TIGIT，強烈表達 DNAM - 1 ，表達一定水平的 PD - 1 ，基本不表達 CTLA - 4。用 IL - 2 和 IL - 15 刺激 pNK 細胞 24 小時，受體表達沒有明顯變化。
- NK - 92 細胞中 TIGIT 的敲除增強了對 NB 細胞系的細胞毒性：用 CRISPR/Cas9 技術敲除 NK - 92 細胞中的 TIGIT，獲得 TIGIT-/-NK - 92 細胞。與野生型 NK - 92 細胞相比，TIGIT-/-NK - 92 細胞對 SK - N - LO 和 SH - EP 細胞的裂解作用增強，但對 LAN - 1 細胞的殺傷作用沒有改變。將 NB 敲除細胞與野生型 NK - 92 細胞和 TIGIT-/-NK - 92 細胞共培養，發現 TIGIT-/-NK - 92 或野生型 NK - 92 細胞與敲除靶細胞共培養時，細胞毒性沒有增強，但 TIGIT-/-NK - 92 細胞對某些敲除細胞（如 PVR-/-SK - N - LO、PVRL2-/-SK - N - LO 等）的裂解作用增強。
- 額外的激活信號改善了細胞毒性活性：由于 NK - 92 細胞不表達 DNAM - 1，研究人員給其裝備了 GD2 - CAR。實驗表明，GD2 - CAR NK - 92 細胞對 SK - N - LO 和 LAN - 1 細胞的裂解作用比野生型 NK - 92 細胞顯著增強，但 TIGIT-/-GD2 - CAR NK - 92 細胞與 GD2 - CAR NK - 92 細胞相比，細胞毒性沒有顯著增強。脫顆粒和干擾素 - γ 釋放實驗也證實，只有 GD2 - CAR NK - 92 細胞在與 SK - N - LO 或 LAN - 1 細胞共培養后脫顆粒增加，TIGIT-/-GD2 - CAR NK - 92 細胞的干擾素 - γ 水平沒有升高。
綜合來看，研究結果表明 PVR/PVRL2 - TIGIT 檢查點軸可能是 NB 的新免疫治療靶點。雖然敲除 PVR 或 PVRL2 不能增強 NK - 92 細胞的細胞毒性，但敲除 TIGIT 能增強對部分 NB 細胞的裂解作用。不過，TIGIT 敲除并不能進一步提高 GD2 - CAR NK - 92 細胞的細胞毒性，這可能是因為該檢查點網絡中其他受體的影響，或者是 GD2 - CAR 引發的信號已達飽和，不受其他信號通路影響。
這項研究意義重大，它確認了 PVR/PVRL2 - TIGIT 網絡在 NB 中的重要作用，強調了這個 IC 網絡的復雜性，單一受體的抑制或激活不足以成為有效的治療方案。雖然敲除 NK - 92 細胞中的 TIGIT 有一定效果，但還需要更深入研究整個網絡。未來，可以考慮針對這個網絡中的多個受體，甚至是網絡之外的靶點進行聯合治療，有望將其與 GD2 - CAR 細胞聯合，為 NB 的免疫治療開辟新道路，給眾多受神經母細胞瘤困擾的患者帶來新的希望。
