自閉癥譜系障礙（Autism Spectrum Disorder，ASD）是一種神經發育障礙，其特征為溝通和社交互動存在差異，還伴有受限、重復的行為及興趣。這是一種異質性疾病，在不同個體間癥狀的嚴重程度和類型各不相同，且在所有種族和經濟群體中均有發生。遺傳和環境因素都被認為在 ASD 的發展中發揮作用。據估計，ASD 的遺傳度約為 80%，多個基因以及基因與環境的相互作用都對其病因有所貢獻。像產前接觸丙戊酸等化學物質以及母體感染等環境因素，也與 ASD 風險增加有關。人們認為這些遺傳和環境因素干擾了神經發育，導致結構和功能異常，進而使 ASD 患者的突觸功能、神經元連接以及腦區之間的溝通發生改變。雖然全基因組關聯研究發現了一些與 ASD 相關的基因，這些基因編碼的蛋白質與突觸形成、傳遞和可塑性有關，但 ASD 的病因仍未完全明確，因其潛在因素多樣且表型表達存在個體差異，被認為具有高度異質性。目前研究雖表明突觸可塑性參與其中，但尚未找到 ASD 發展的共同機制。

在探尋 ASD 共同機制的過程中，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路受到了關注。mTOR 通路是一條高度保守的信號通路，參與蛋白質合成、細胞生長、代謝和自噬等一系列生理過程，在突觸可塑性調節中也起著重要作用。該通路包含兩個復合物，即 mTORC1 和 mTORC2，其調節受多種上游信號通路控制，如 GSK3β、TSC1/TSC2、PI3K/Akt 以及各種生長因子和營養物質等。mTORC1 通過 S6K 和 4E-BPs 介導蛋白質合成，還通過 Ulk-1/Beclin/LC-3 自噬通路調節自噬；mTORC2 則參與細胞存活、增殖和肌動蛋白細胞骨架調節等過程，同時還在 mTORC1 上游調節 Akt。

mTOR 通路失調與多種疾病相關，如癌癥、阿爾茨海默病、糖尿病和癲癇等，近年來也被發現與神經精神疾病有關。有研究表明，mTOR 信號通過調節神經元棘密度（如突觸修剪機制）在 ASD 病因中發揮作用。在 ASD 患者中已鑒定出 mTOR 通路相關基因的變異，在構建的 ASD 動物模型研究中也證實了 mTOR 信號存在異常。然而，mTOR 通路失調是否是 ASD 的基本共同機制，以及 mTOR 信號如何參與其中，仍有待明確。

本研究旨在通過對多種遺傳和環境 ASD 動物模型進行系統綜述和薈萃分析，比較 mTOR 的調節情況。研究過程中考慮了物種、年齡、性別、模型類型和腦區等因素，進行了亞組分析。期望通過找到 mTOR 調節的共同變化，更好地理解 ASD 病因；同時，分析不同動物模型中 mTOR 的差異調節，也有助于認識 ASD 的異質性。

在研究方法上，該綜述旨在探究 ASD 動物模型大腦中 mTOR 通路相關蛋白相較于野生型動物的變化情況。研究方案預先在 PROSPERO 注冊，報告遵循系統評價和薈萃分析的首選報告項目（PRISMA）清單。通過檢索 PubMed 和 Web of Science 數據庫獲取相關研究，檢索詞包含動物模型、ASD 和 mTOR 通路相關內容。利用 Rayyan 和 Endnote 軟件導入文獻記錄并去除重復項，隨后對剩余文獻進行盲法篩選。篩選分兩個階段進行，第一階段根據預設標準篩選標題和摘要，排除非原創研究、未研究 ASD 動物模型或未分析 mTOR 通路相關蛋白或基因表達的研究；第二階段對剩余文獻的全文進行篩選，進一步排除不符合標準的研究，如未研究遺傳或誘導的 ASD 動物模型、未與野生型或對照動物比較、未對至少一種 mTOR 通路相關蛋白或基因進行分子測量以及無全文的研究等。對于遺傳 ASD 模型，依據 SFARI 數據庫確定相關基因；對于環境誘導模型，納入丙戊酸（VPA）處理、丙酸（PPA）處理或母體免疫激活等已確立的模型，以及表現出自閉癥樣行為特征的新模型。

研究人員提取了研究特征和結果數據，包括研究信息、動物模型細節、結果測量指標和測量特征等。對納入研究的 ASD 模型組和對照組的所有結果測量數據進行提取，包括均值、標準差（SD）或標準誤（SEM）以及動物總數（n）。若數據未在文獻中明確給出，會使用 WebPlotDigitizer 工具進行提取，必要時還會聯系作者獲取。提取后的數據會根據年齡組和特定腦區進行標準化處理。

為評估納入研究的內部有效性，研究人員對潛在的偏倚風險進行了評估。由于系統綜述包含大量文獻，且預計部分文獻因報告不充分存在 “偏倚風險不明確” 的情況，所以隨機抽取了 50 篇文獻（占 26%），使用 SYRCLE 動物研究偏倚風險工具進行分析。評估項目包括隨機化、治療或分組分配的盲法等，對于基因 ASD 模型研究，部分項目不適用。同時還評估了報告質量相關問題，如是否報告了功效分析、隨機化和盲法等。偏倚風險評估由兩人獨立進行，有分歧時通過討論解決。

對于至少有兩項研究提供數據的每個結果，研究人員進行了薈萃分析。計算標準化均數差（SMD），使用 Hedges’ g 校正，并給出 95% 置信區間（95% CI）。若同一對照組用于多次比較，會對其進行校正；若同一隊列報告了多個相似結果，則納入效應量最高的結果；若樣本量報告為范圍，則取最小值進行薈萃分析。采用隨機效應模型，考慮個體研究的精度和研究間的差異進行加權分析，使用 Comprehensive Meta-Analysis 4.0 軟件進行薈萃分析，并通過森林圖展示總體效應量和異質性水平（I²）。若每個亞組至少有 10 個獨立比較，則進行預設的亞組分析，使用 Q 檢驗評估亞組間的差異。

為檢測潛在的發表偏倚，當每個結局指標的研究數量超過 15 項時，研究人員會在 R 中創建漏斗圖，并通過 Duval 和 Tweedie 的修剪填充分析以及 Egger 回歸分析評估小研究效應。由于標準化均數差（SMDs）可能導致漏斗圖失真，所以將 SMD 與基于樣本量的精度估計值（1/√(n)）進行繪制。

經過全面檢索和嚴格篩選，在 PubMed 和 Web of Science 數據庫中最初檢索到的文獻去除重復項后，剩余 1137 條記錄。經標題和摘要篩選，437 條記錄符合進一步評估標準，再經全文篩選，最終 213 篇文章納入系統綜述，192 篇適合納入薈萃分析和后續偏倚風險評估。

納入綜述的 213 項研究的特征詳見補充文件 2。納入薈萃分析的 192 項研究共產生 793 個比較結果，涉及多種蛋白質。其中，關于（p-）AKT、（p-）S6 和（p-）mTOR 的比較最多，分別有 200 個、118 個和 116 個；其次是 LC3B、（p-）GSK3β 和 Beclin-1。在動物模型方面，大部分比較使用小鼠（636 次），其次是大鼠（151 次），斑馬魚和果蠅各使用 3 次。小鼠模型中，C57BL/6 品系使用最多（439 次），大鼠模型中 Wistar 大鼠使用最多（91 次）。在模型類型上，537 個比較使用遺傳模型，127 個使用丙戊酸誘導的 ASD 樣表型模型，還有母體免疫激活、干擾母體睡眠、丙酸處理和近交表型模型等環境模型。數據報告中，部分針對雄性（409 次）或雌性（67 次），部分為兩性合并（83 次），還有 232 次未指明動物性別。研究中使用的動物大多為青春期（247 次），其次是成年（195 次）、幼年（180 次）和產前（22 次），146 次未報告動物年齡。多數研究采用群居方式飼養動物（44 次），少數單獨飼養（3 次），還有 121 次未報告飼養條件。在分子檢測方法上，蛋白質印跡法（Western blots）使用最多（631 次），其次是 PCR（82 次）、免疫染色（53 次）、ELISA（23 次）和 RNA 測序（1 次）。分析的腦區主要集中在海馬體（348 次）和皮層（182 次），還有全腦分析（98 次）。

使用 SYRCLE 偏倚風險工具對隨機抽取的 50 篇文獻進行評估發現，在隨機序列生成和分配隱藏方面，50 項研究中僅有 1 項報告；動物飼養的隨機化在所有研究中均未提及。盲法執行、隨機結果評估和盲法結果評估的執行率略高，但仍低于樣本的 20%。在報告質量方面，50 項研究中僅有 4 項報告使用功效分析確定合適的樣本量，17 項報告了某種形式的隨機化，超過 50% 的研究提及了某種盲法。

對至少有兩項獨立研究比較的每種蛋白質分別進行薈萃分析。在分析的 31 種蛋白質中，13 種在 ASD 模型和對照組之間存在顯著差異。PTEN、Beclin-1、LC3-II 和 Rictor 表達降低，而 p-Rictor、p-Ulk1、p-EIF4e、EIF4e、Ulk1、p-mTOR、p-S6K、p-AKT 和 p-S6（磷酸化位點為 235/236）表達增加。這表明 mTOR 通路的上游蛋白以及下游的 mTORC1 和 mTORC2 均發生了相關改變。

若每個亞組至少有 10 個比較，則對每種蛋白質進行亞組分析。部分蛋白質如 p-GSK3β（Ser9 磷酸化）、mTOR 和 p-S6（240/244/245 磷酸化）雖總體效應不顯著，但亞組分析發現了顯著的亞組效應。Beclin-1 顯著下調，在所有亞組中均有一致的顯著效應，在環境誘導的 ASD 模型和大鼠模型中的下調作用比遺傳模型和小鼠模型更強。LC3-II 總體顯著下調，但亞組分析顯示僅部分亞組有相同的顯著效應，在大鼠模型和環境誘導的 ASD 模型中顯著下調，在小鼠模型中不顯著。p-Akt 的亞組分析表明，僅海馬體腦區和青春期、成年動物組以及環境誘導和遺傳模型組有顯著效應，在大鼠研究的亞組中未顯示顯著效應。PTEN 在幾乎所有分析的亞組中均顯著下調，但全腦區域的效應不顯著。p-mTOR 的表達差異高度依賴年齡和腦區，青春期和成年動物以及海馬體組織中顯著上調，在幼年動物、皮層和全腦分析中不顯著。p-EIF4e 在遺傳模型和海馬體亞組中顯著上調。p-S6K 在除皮層組織和青春期動物亞組外的其他分析亞組中均顯示顯著上調。磷酸化的 S6（235/236 位點）總體顯著上調，在小鼠模型和遺傳模型亞組中得到證實；而磷酸化的 S6（240/244/245 位點）在所有納入比較中未顯示顯著效應，僅在海馬體亞組中顯著上調。

僅對至少有 15 項獨立研究的結局進行發表偏倚分析。漏斗圖分析表明部分研究存在不對稱性，Egger 回歸檢驗顯示 p-AKT 存在潛在發表偏倚。Duval 和 Tweedie 的修剪填充分析為 6 種分析蛋白質（LC3-II、p-eIF4e-bp、p-mTOR、p-S6、p-S6K 和 PTEN）添加了額外數據點，表明存在發表偏倚，且這些蛋白質的匯總效應量可能被略微高估。

本研究旨在探討 mTOR 失調是否為 ASD 的共同機制，通過分析多種遺傳和環境動物模型中 mTOR 通路相關蛋白的調節情況，發現 mTOR 通路失調可能是與 ASD 病因相關的共同機制。Beclin-1 表達在總體和所有可評估的亞組分析中均持續下調，表明自噬失調可能是 ASD 潛在的共同機制。

近年來，mTOR 通路在 ASD 中的作用受到越來越多關注。已有研究發現 ASD 患者中 mTOR 活性增加，動物研究也揭示了 mTOR 失調導致 ASD 病因的多種機制。例如，mTORC1 活性增加可通過磷酸化 4E-BP1 和 S6K1 增加蛋白質合成，改變突觸蛋白產生，從而導致 ASD 樣表型；同時，mTORC1 活性增加還會抑制自噬，而自噬受損與細胞穩態破壞有關，這也是 ASD 的一個影響因素。

本研究的薈萃分析結果顯示，ASD 動物模型中 mTOR 總體活性增加，PTEN、Beclin-1、LC3-II 和 Rictor 表達降低，而 p-S6、p-Ulk1、p-Rictor、p-EIF4e、p-S6K、Ulk1、p-AKT 和 p-mTOR 表達增加。mTORC2 活性增加體現在 p-Akt 和 p-Rictor 的增加上，其他蛋白質則表明 mTORC1 活性增加。mTOR 雖總體效應不顯著，但在大鼠、環境模型和海馬體亞組中顯著上調。這些結果與某些綜合征型自閉癥（如由 PTEN、TSC1 和 TSC2 基因突變導致 mTOR 過度激活）的情況相符，也表明環境 ASD 動物模型中同樣存在 mTOR 過度激活。EIF4e 和 p-EIF4e 表達增加表明 mTORC1 下游的翻譯通路上調，在 ASD 患者中也發現 p-EIF4e 水平升高，且在重度患者中更為明顯。

尤為重要的是，本研究在蛋白質水平的結果表明，自噬減少是 ASD 的共同機制，這與 mTORC1 活性增加的影響一致。自噬是降解受損蛋白質、維持神經元穩態的重要細胞過程，近期研究發現其與 ASD 兒童的智力能力相關。本研究中 mTORC1 下游的自噬通路總體下調，Beclin-1 在所有分析亞組中均減少，LC3-II 表達也總體降低。Beclin-1 可將 LC3-I 轉化為 LC3-II，觸發自噬體形成，而 mTORC1 可通過磷酸化 Ulk1（Ser757 位點）使其失活，從而抑制該通路。本研究還發現 p-Ulk1 和 Ulk1 表達增加。在發育過程中，自噬受損可能影響網絡組織和突觸功能，進而導致 ASD 的行為和認知癥狀。研究還表明，Beclin-1 和 LC3 等自噬相關蛋白減少可能引發神經炎癥，通過促進神經免疫失調進一步加重 ASD 癥狀。此外，調節 mTOR 通路或使用組胺 H3 受體拮抗劑等恢復 Beclin-1 活性的干預措施，在臨床前模型中已顯示出緩解部分自閉癥相關行為的潛力。

考慮到 ASD 在個體間存在社會、認知和行為癥狀的臨床異質性，找到共同的潛在機制意義重大。本研究納入多種動物模型，反映了 ASD 的臨床異質性。Beclin-1 在遺傳和環境誘導的模型以及所有其他亞組中均下調，表明自噬通路可能是一個潛在的研究靶點。

通過亞組分析，研究人員發現 mTOR 調節在物種、年齡、性別、腦區和誘導 ASD 樣表型的方式（模型類型）上存在差異。Beclin-1 在所有亞組中均有下調，但在大鼠和環境誘導模型中更為明顯；LC3-II 的表達降低主要由大鼠驅動。部分蛋白質的表達增加具有腦區特異性，如 p-S6K、p-S6（240/244/245）、mTOR 和 p-mTOR 在海馬體中上調，在皮層亞組中無此現象；PTEN 的下調僅在海馬體中顯著，這突出了海馬體在 ASD 中的作用，但也可能與納入比較中海馬體的主導代表性有關。亞組分析還揭示了年齡依賴性差異，p-mTOR 和 p-Akt 在成年和青春期亞組中表達增加，在幼年亞組中無此現象，表明 mTOR 過度活躍可能在發育后期更為明顯；而 p-S6K 和 p-S6（235/236）在僅研究青春期動物時未上調。p-Akt 的上調似乎存在性別特異性，在雌性中下調，在雄性中上調，不過由于大多數研究使用雄性動物或未明確性別，導致雌性代表性不足，這一結果仍需進一步研究，因為 ASD 存在性別差異，且 mTOR 調節可能受雌激素等性激素影響。

本研究分析了 1500 多篇參考文獻，最終納入 213 篇進行綜述，192 篇進行薈萃分析。大量證據提高了大多數感興趣蛋白質研究結果的準確性和可靠性，但對于部分蛋白質（如 Beclin-2、mTOR 激酶、pPTEN、pPTEN、p-Raptor、Rheb、TSC1），納入薈萃分析的研究數量不足。

研究存在一些局限性。納入標準僅包括測量直接蛋白質或 RNA 水平的報告，且排除了非英文報告；搜索策略涵蓋目前已知的所有 mTOR 相關蛋白，可能遺漏未來研究中發現的新相關蛋白。ASD 模型的定義也可能存在局限，<