中山大學孫逸仙紀念醫院蘇士成教授、許小丁教授與中山大學附屬第三醫院高志良教授合作，在非酒精性脂肪性肝炎領域發表了題為“Targeting Mitochondria-Located circRNA SCAR Alleviates NASH via Reducing mROS Output”的研究性論文。該論文應用Arraystar Human CircRNA芯片篩選鑒定出與非酒精性脂肪性肝炎發生相關的環狀RNA分子SCAR，功能研究表明，在線粒體中過表達circRNA SCAR會抑制肝臟成纖維細胞的活化并抑制相應的炎癥反應，敲低則有相反的表型。機制研究發現，由脂質暴露引發的內質網應激（ER stress）會上調CHOP的表達，CHOP通過抑制PGC-1α的轉錄從而導致線粒體中circRNA SCAR表達量的下降。circRNA SCAR表達量的下降使得原本與其結合的ATP5B轉而與CypD結合導致mPTP通道開放。開放的mPTP通道能夠使線粒體中的ROS釋放到細胞質中，而ROS作為一類活性氧物質能夠增強肝臟成纖維細胞的促炎能力從而導致肝臟炎癥的加重�？傮w而言，該研究解決了非酒精性脂肪性肝炎發生發展機制的重要問題，發現了線粒體circRNA的重要功能并發展了一系列相關的實驗方法，為后續研究奠定了基礎并指明了方向。該研究成果于2020年10月發表在國際著名學術期刊Cell (IF: 38.637)上。（芯片實驗由康成生物丨數譜生物提供技術服務）

研究背景

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）屬于脂肪肝病的一種，相比于單純性肝脂肪變性，該病引發的肝損傷更加嚴重，患者易于出現肝纖維化并引發相關肝臟疾病如肝硬化甚至肝癌的產生。據報道稱，非酒精性脂肪性肝炎的全球患病率大約在3%-5%。因此，對該病的研究具有重要的科學意義和應用價值。

環狀RNA（circRNA）是一類將線性RNA分子的3’端和5’端通過反向剪切共價連接形成的環狀RNA分子，可以由外顯子、內含子或者同時包含這兩種序列的片段組成。與線性分子相比，這種環形的結構可提高環狀RNA的穩定性。環狀RNA發揮功能主要有四種機制：1、環狀RNA可以通過吸附miRNA發揮ceRNA機制。2、環狀RNA可以結合特定的蛋白，調控靶蛋白的功能。3、某些環狀RNA具有潛在的翻譯能力，能夠產生具有活性的短肽。4、環狀RNA能夠結合DNA影響基因的表達。

技術路線

研究思路

1. CircRNA高通量篩選及臨床數據研究

為了研究影響非酒精性脂肪性肝炎（NASH）發生的具體機制，作者選取了四份NASH患者肝成纖維細胞樣本，通過與正常樣本進行對比，采用Arraystar Human CircRNA芯片篩選了差異倍數大于2，P值小于0.05的指標（圖1A）。由于ROS的主要來源是線粒體，故作者重點尋找了線粒體定位的環狀RNA，最終找到在NASH患者肝成纖維細胞線粒體中表達下調的環狀RNA分子SCAR（圖1B），并通過RNase R消化、免疫熒光等實驗驗證了這一點（圖1C）。進一步，通過對臨床數據的分析，結果表明肝成纖維細胞中環狀RNA分子SCAR的水平與其細胞內ROS含量呈反比且和整體肝臟健康程度呈正相關關系（圖1D），表明SCAR確實可能與NASH的發生相關。

2. 功能研究

為了證實環狀RNA分子SCAR具有引發NASH的功能，作者在肝成纖維細胞線粒體中過表達了這一環狀RNA。通過ELISA等實驗表明，過表達SCAR后，肝成纖維細胞內從線粒體釋放到細胞質中的ROS量明顯減少（圖2A），并且能夠抑制肝成纖維細胞的活化以及炎癥因子的釋放（圖2B、2C、2D）。此外，敲低該分子則有相反的表型。除了細胞實驗外，作者在小鼠模型上通過免疫組化等實驗發現過表達SCAR使肝部浸潤巨噬細胞減少（圖2E）。因此，SCAR確實具有抑制NASH的能力并具有潛在的治療價值。

3. 機制研究

進一步的，針對SCAR引發NASH的下游機制這一問題。首先作者通過RNA pull down與質譜聯用的方式找到了SCAR的結合蛋白ATP5B并確定了它們間的結合區域（圖3A、3B）。已有文獻表明，ATP5B作為線粒體上mPTP通道的組成蛋白之一，可以影響該通道的開放程度，因此作者利用IP等技術深入研究了SCAR對于mPTP通道的影響。結果發現：環狀RNA分子SCAR能夠阻礙CypD蛋白結合ATP5B，從而導致mPTP通道無法開放（圖3C）。因此，在SCAR表達量減少的情況下，mPTP通道能夠被CypD結合并開啟，從而使得線粒體內的ROS釋放到細胞質中（圖3D），進而導致肝成纖維細胞的細胞因子釋放減少（圖3E）。

最后，作者進一步研究了調控SCAR表達量的上游機制。通過CLIP-seq、RIP及q-PCR實驗表明，肝成纖維細胞在脂質暴露的情況下發生的內質網應激（ER stress）導致CHOP蛋白表達量下降，進一步使PGC-1α表達量下降（圖4A），PGC-1α通過調控轉錄（圖4B），從而最終使得SCAR的表達降低（圖4C）。

結果展示

圖1. Arraystar Human CircRNA芯片篩選及驗證結果。

A：差異circRNA聚類圖（FC≥2，P<0.05，n=4），在NASH模型病人中找到一個明顯下調的環狀RNA分子SCAR（hsa_circ_0089762）。
B：SCAR對應在線粒體基因組上的位置（以紅框標注）。
C：Rnase R處理后，Q-PCR驗證SCAR的環狀結構以及SCAR在NASH患者中的表達情況。
D：NASH患者肝臟硬度與SCAR成纖維細胞數目的相關性分析。

圖2. 過表達SCAR抑制NASH相關表型。

A：正常肝成纖維細胞在使用棕櫚酸酯模擬脂質暴露的情況下，過表達SCAR對于細胞質中ROS（cROS）含量的影響。
B：Western blot檢測過表達SCAR對于NASH患者肝成纖維細胞活化的影響。
C：過表達SCAR對NASH患者肝成纖維細胞收縮性的影響。
D：過表達SCAR后NASH患者肝成纖維細胞釋放的細胞因子總量變化情況。
E：在高脂喂養小鼠模型中，過表達SCAR導致肝組織中浸潤的巨噬細胞減少。

圖3. SCAR發揮功能的下游機制。

A：RNA pull down以及質譜檢測SCAR結合蛋白。
B：RIP實驗鑒定ATP5B與SCAR的結合情況。
C：SCAR影響CypD與ATP5B的結合。
D：SCAR與CypD對于肝成纖維細胞的細胞質中ROS釋放的影響。
E：ELISA檢測SCAR與CypD對于肝成纖維細胞釋放細胞因子的影響。

圖4. 調控SCAR表達量的上游機制。

A：棕櫚酸酯模擬脂質暴露的情況下，CHOP表達量上升，PGC-1α表達量下降，敲低CHOP蛋白后PGC-1α表達量降低。
B：ChIP實驗分析棕櫚酸酯處理下PGC-1α與SCAR啟動子區結合情況。
C：PGC-1α敲低抑制SCAR表達。

研究意義

作者利用Arraystar Human CircRNA芯片在NASH患者肝成纖維細胞中找到了影響NASH發生發展的線粒體定位環狀RNA分子SCAR，在臨床樣本驗證中發現SCAR的表達與人體肝臟健康程度顯著相關。細胞層面上的功能研究表明SCAR與線粒體ROS釋放相關，并且能夠抑制肝成纖維細胞的活化以及炎癥因子的釋放，而小鼠模型上的研究則表明SCAR能夠減輕肝硬化的表型。最后作者通過一系列的機制實驗研究發現，在脂質暴露的情況下出現的內質網應激會導致CHOP及其下游PGC-1α的減少，進而導致SCAR的表達量下降。SCAR的減少會導致原本與其結合的ATP5B轉而與CypD結合，從而使線粒體上mPTP通道開放并將ROS釋放到細胞質中最終引起NASH�？傮w而言，這項工作思路清晰，數據詳實，具有很高的科研價值與應用價值，為NASH的治療提供了新的思路與方法。

文章鏈接：
https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092-8674(20)31000-X